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手性胺作为许多具有药物活性或生物活性的化合物的重要中间体,其高效而绿色的合成途径是近年来的研究热点。连续流生物催化具有催化效率快、时空产率高,易于分离催化剂与反应液等优点,已被确定为可持续工业生产的重要绿色研究领域。本课题在已获得高活力及高对映体选择性的S型选择性ω-转氨酶ATA-W12的基础上,对其共价固定于环氧基树脂上的工艺进行了研究,并应用于连续流反应系统,对连续流系统的催化效率及可持续性能进行了考察。本文主要研究内容如下:(1)环氧树脂的筛选与氨基化修饰。以酶活回收率和蛋白吸附率为指标对4种环氧基树脂进行了预筛选,确定最佳环氧载体为107s。以乙二胺(EDA)为修饰试剂在107s上接入部分氨基,载体接触角的减小说明载体经修饰后亲水性增强;EDA反应时间达4 h时载体达到修饰平衡,氨基修饰密度最大约为70 μmol/g载体;扫描电镜结果表明氨基修饰对载体的结构和形态不会造成影响。(2)固定化条件的优化及固定化酶性质的研究。优化ATA-W12固定于氨基-环氧基双官能团树脂(EDA-Epoxy Supports,EES)上的固定化条件,确定载体最佳氨基修饰密度为20μmol/g载体,蛋白负载量为7.2 mg蛋白/g载体,固定化时间为6 h;优化并确定固定化酶ATAW12@EES的最适反应条件为100 mM pH 8.0磷酸盐缓冲液,37℃。在稳定性研究中,ATAW12@EES在4℃条件下存储30天后约有89%的酶活残留,经重复使用20次后保有约85%的残余酶活,在多个pH条件下均表现出比游离酶更强的耐受性,ATAW12@EES良好的稳定性为其实现大规模应用奠定了基础。(3)连续流反应系统的建立。将固定化酶ATAW12@EES填充于玻璃层析柱(长度10 cm,内径10 mm)中,对连续流工艺进行了条件优化,确定最适条件为:流向从上至下,填料量2.5 g,流速0.4 mL/min。在该条件下进行(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的连续不对称合成,时空产率可达930.73 g·L-1·d-1,在持续工作24 h后反应转化率仍在90%以上,说明以该方式进行(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的高效、连续生产具有非常高的可行性。(4)ATA-W12与辅因子PLP的共固定化。由于PLP价格昂贵且后续分离困难,我们对ATA-W12与PLP的共固定化进行了研究。首先使用亚氨基二乙酸(IDA)和CoCl2修饰107s,用于定向固定并纯化带有His tag的ATA-W12;PLP的共固定化则通过乙二胺(EDA)、乙醇胺(eA)或聚乙烯亚胺(PEI)对107s进行进一步修饰。结果显示PEI修饰后的载体PLP负载量为9.37 μmol/g,所得共固定化酶酶活回收率为106%,重复使用30个批次后还保有约90%的残余酶活,以0.5 mL/min和1.0 mL/min的流速进行S(-)-α-甲基苄胺的连续脱氨反应,分别持续工作约8h和4 h后没有明显酶活损失,具有出色的稳定性。反应过程中无需添加外源PLP,大大降低了反应的经济成本。