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一急性白血病中MDR1、MRP和Bcl-2基因表达及其临床意义 以MDR表型显著、具有MDR1/P-gp高表达的白血病细胞株HL-60/VCR为参照,应用敏感的DIG掺入半定量RT-PCR方法,检测了9种肿瘤和白血病细胞株以及54例急性白血病患者MDR1基因表达,建立了较为客观、量化的判定阳性的指标,同时采用常规RT-PCR方法检测了这批患者MRP和Bcl-2基因的表达。结果表明,54例急性白血病中,16.7%(9/54)的患者MDR1/MRP/Bcl-2三基因表达均为阳性,46.3%(25/54)的患者MDR1/MRP/Bcl-2三基因表达均为阴性。46例资料完整的白血病患者中,三基因表达均阴性者其完全缓解率(CR)为80.0%,而MDR1/MRP或MDR1/MRP/Bcl-2共表达者则无一人获得CR(P<0.005)。单基因分析表明MDR1、MRP、Bcl-2基因表达阳性率分别是28.3%、41.3%和47.8%,其中MDR1阳性者CR率15.4%,明显低于MDR1阴性者的CR率(72.7%, P<0.005);MRP阳性CR率26.3%,明显低于MRP阴性者的CR率(77.8%,P<0.005);Bcl-2阳性CR率36.4%,亦低于阴性CR率75.0%(P<0.05)。MDR1/MRP或MDR1/MRP/bcl-2共表达的患者临床上不易获得CR。以上结果表明,白血病患者的耐药除了与MDR1高表达密切相关外,还与非P-糖蛋白介导的MRP及bcl-2表达相关。 二转移MDR1基因的白血病细胞K562/MDR的耐药特性研究 采用PA317/HaMDR细胞的病毒上清转染白血病细胞K562,获得了MDR1转基因细胞K562/MDR,PCR和RT-PCR证实了原病毒在靶细胞中的整合和表达。FCM进一步分析了K562/MDR中MDR1基因产物P-gp以及MRP、LRP、BCRP 逆转录病毒介导的转基因技术在白血病耐药机理研究中应用 摘 要 以及GST。等多种与非经典耐药相关蛋白的表达。结果发现,与K562母株相比, K562/MDR细胞高表达P-gp,gyl增加了96.2%,卜性表达率从0.58%上升至 98.0%;其它耐药蛋白的gyl和阳性率均无明显差异。MTT试验证实K562/MDR 细胞对化疗药物的耐受性,CsA与CRE单独或联合使用可逆转其耐药表型。以 上结果表明K562/MDR细胞的耐药表型全为外源性MDRI基因表达的P唱p所致 的经典MDR表型,而非其它耐药相关蛋白所介导,基因修饰的耐药细胞株由于 其单因素耐药更能作为理想的研究多药耐药逆转的体外实验模型。 三 逆转录病毒介导的反义MDRI基因的转移 以HL60/VCR细胞总KNA为模板,自行设计引物,应用RTPCR方法获得 MDRI基因CDNA片段,利用分子克隆方法反向插入逆转录病毒载体pLXSN, 获得了携带反义MDRI基因的重组逆转录病毒载体pLASSN,应用脂质体转导 包装细胞,单、双噬型包装细胞的交互感染,获得较高滴毒的病毒上清成功转染 耐药靶细胞K562/MDR,PCR和RTPCR证实了反义MDRI基因在靶细胞中的 整合和表达。巢式PCR和补救分析证实双噬型重组病毒的安全性,表明逆转录 病毒介导的基因转移系统以其高效、安全、稳定整合等优点,对转移反义基因也 不失为一个较好的实验系统。希望通过逆转录病毒介导的MDRI基因转移从基 因水平阻断MDRI基因的转录和翻译,增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,从 而达到杀灭肿瘤细胞的目的。 四MDRI基因反义RN^抑制P飞P表达及功能的研究 首先通过细胞计数配合台盼蓝染色测定K562MDWLAASN的生长曲线,半 定量RTPCR分析内源性MDRI基因的表达,FCM测定了P唱p的表达,结果表 明,K562MDRjLAASN细胞的生长未受反义基因转移的影响;MDRI基因mRNA 的转录基本不受的影响,而P唱p的表达明显受抑,与对照相比,其相对荧光强。_度Afl下降了86o,阳性率也从96.20降至52.60,表明MDRI反义RNA对靶 基因的影响发生在转录后的水平上。采用细胞形态、MTT检测、集落生成试验。 DNA Ladder分析及凋亡相关基因的表达等检测方法,分析了多种药物对 ,K562MDR/LASSN细胞增殖和凋亡的作用。结果显示,当化疗药物VCR、COL\4’* 作用于K562MDR/LASSN时,它对药物的耐受性比耐药对照细胞明显下降,如 ICS。VCR、IC50C。Lb耐药对照K562MDR/NC*细胞分别下降了 56.7%和 56*%; --多 逆转录病毒介导的转基因技术在白血病耐药机理研究中应用 摘 要 在 100 p g/L VCR作用下,K562MDR/LASSN细胞的集落生成能力比对照细胞下 降了92.4%;随着VCR作用浓度的增加、作用时间的延长,K562MD肌A驼N 细胞比对照在更早的时间或更低的浓度上出现DNA梯带。以上结果证实了反义 RNA的有效性。反义KNA的表达,抑制了P唱p的表达和功能,以致细胞内被 泵出的药物减少,蓄积增加,使化疗药物的细胞毒效应得到有效