目的:肝癌发病率,死亡率高,手术治疗适应范围有限,药物治疗也有明显的毒副作用和耐药性问题,其发生是一个复杂的多步骤的与多种遗传变异相关的过程,因此寻找新的治疗靶点对于延长肝癌患者的生存期具有至关重要的作用。DEK基因于1992年在一种急性髓性白血病中被发现,其编码的蛋白是一种结构蛋白,参与DNA损伤修复,m RNA剪接,转录调节,分化等各种进程,与细胞的增殖、凋亡密切相关。研究发现DEK在许多恶性肿瘤的表达量明显高于正常组织,过表达会促进癌症的发生和发展。DEK是否在原发性肝癌的发生发展中有重要作用,目前的研究很少。本课题组前期研究证实了DEK在肝癌病人组织中高表达。本研究继续以DEK在肝癌细胞增殖、凋亡、迁移过程中的作用及潜在机制为核心,从体内和体外揭示肝癌发生、发展的机制,为进一步探索肝癌研究的新方法提供理论依据。方法:1.DEK敲低和过表达重组质粒的构建及验证。2.DEK敲低和过表达重组质粒进行慢病毒包装。3.筛选DEK高表达的肝癌细胞株:根据细胞背景选择如下4种肝癌细胞Bel-7402、Huh7、Hep G2和SMMC-7721,采用Real-Time PCR和Western Blot分别检测DEK m RNA及蛋白质的表达水平,筛选出两株DEK表达量高的肝癌细胞用于后续实验。4.DEK敲低和过表达重组慢病毒感染肝癌细胞,嘌呤霉素筛选2周后分别用Real-Time PCR和Western Blot检测DEK m RNA及蛋白质的表达水平,构建DEK稳定敲低和过表达的肝癌细胞株。5.DEK敲低后对肝癌细胞生物学行为的影响:选择DEK敲低效率更高的稳转细胞株,分别用CCK8细胞增殖实验,流式细胞仪技术检测肝癌细胞的增殖、凋亡及细胞周期分布,细胞划痕修复实验来检测肝癌细胞的迁移能力。6.DEK敲低和过表达后裸鼠皮下成瘤研究,选择30只4-6周BALB/C裸鼠,分成6组,即OE组、OE-Control组、NC组、sh-Control组、KD1组和KD3组,每组右侧腋下注入等量的处于对数期的细胞悬液,观察裸鼠的生长速度、存活与体重变化,成瘤时间、肿瘤生长速度与体积。待瘤子长出后每隔两天测瘤子的最长径和最短径,计算瘤体积。5周后处死裸鼠,取出瘤子,测体积、称重,解剖裸鼠观察是否有转移。结果:1.酶切鉴定及测序鉴定证实成功构建DEK敲低和过表达重组质粒。2.对照组荧光表达证实成功包装慢病毒。3.Real-Time PCR结果显示肝癌细胞株Bel-7402、Huh7、SMMC-7721、Hep G2中Bel-7402和Huh7两株肝癌细胞DEK mRNA表达量较高。4.Western Blot结果显示肝癌细胞株Bel-7402、Huh7、SMMC-7721和Hep G2中Bel-7402和Huh7两株肝癌细胞DEK蛋白表达量较高。5.Real-Time PCR及Western Blot结果显示与阴性对照相比,转入的重组敲低和过表达质粒均能有效的升高或降低DEK的表达。选择DEK敲低效率更高的稳转细胞进行后续的实验。6.CCK8实验得到各组细胞在12、24、48和72h的吸光度值,结果显示Bel-7402及Huh7敲低组细胞在24、48和72h的吸光度值较空白对照及阴性对照均明显降低(p<0.05),差异有统计学意义。7.流式结果显示Bel-7402和Huh7敲低组细胞凋亡率明显高于空白对照组和阴性对照组(p<0.05),差异均有统计学意义。8.划痕实验结果显示Bel-7402和Huh7敲低组细胞划痕愈合率明显低于空白对照组和阴性对照组(p<0.05),差异均有统计学意义。9.流式检测细胞周期的结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,两种细胞敲低组的G0-G1期的比例升高,S期降低,Bel-7402的G2-M期也降低(p<0.05),差异均有统计学意义。10.裸鼠皮下成瘤实验结果显示,DEK过表达组移植瘤的平均体积较大,而DEK敲低组移植瘤的平均体积较小。结论:1.本实验成功构建了DEK敲低和过表达重组质粒,并成功进行了慢病毒包装。2.筛选出了DEK表达量高的Bel-7402和Huh7两株肝癌细胞。3.成功构建了DEK稳定敲低和过表达的肝癌细胞株。4.体外细胞功能实验证实:靶向沉默肝癌细胞中DEK的表达,能够抑制细胞增殖、迁移能力,诱导凋亡,并使细胞周期阻滞在G0/G1期。5.在体内动物水平,裸鼠皮下成瘤实验表明,靶向沉默DEK基因抑制肝细胞移植瘤的生长。