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由于神经元死亡不可再生,许多中枢神经系统疾病如神经系统变性病、脊髓损伤等长期以来都缺乏良好的治疗方法,利用神经干细胞进行细胞替代治疗虽然可行,但神经干细胞的来源不足,所以人们努力寻找促进细胞增殖的方法;同时,也是由于神经元死亡不可再生,许多疾病如脑缺血、脑梗塞、脑瘫的预后都不尽如人意,人们也力图探寻抑制细胞增殖的机制,从而从根本上治疗。
低氧已被报导可促进多种细胞增殖,但同时在多种疾病导致细胞死亡的过程中也扮演重要角色。低氧对细胞存活的影响其现象已十分明确,但机制仍不清楚。低氧可使氧敏感的钾通道开放,细胞去极化,从而激活电压依赖型钙通道,使钙离子内流,发挥其促进囊泡释放、影响细胞增殖周期等作用,而在众多电压依赖型钙通道中,L型电压依赖型钙通道最为重要。同时低氧下的核心调控因子是低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α),其在常氧下被降解,在低氧下进入细胞核,与多种辅因子结合,作为转录因子启动下游靶基因的转录。因此,我们推测:低氧时HIF-1α可能通过影响L型电压依赖型钙通道的表达来影响细胞内钙的浓度,进而对细胞存活产生影响。
方法和结果:
1、低氧对PC12细胞增殖的影响
PC12细胞分别经常氧和3%或10%低氧处理24hr后,进行细胞计数或加入MTS测定细胞活力。统计结果均表明,3%低氧处理后抑制PC12细胞的体外增殖,10%低氧处理后促进PC12细胞的体外增殖。
2、常氧、低氧条件下细胞内低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和钙离子浓度的变化
2.1、常氧、低氧条件下低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的蛋白和mRNA的改变
PCI2细胞分别经常氧和3%或10%低氧处理24hr后,提取细胞内总蛋白进行Westernblot实验或提取细胞内总RNA进行real-timePCR实验。结果表明,3%低氧处理后,HIF-1α的蛋白表达增加,mRNA表达降低;10%低氧处理后,HIF-1α的蛋白表达增加,mRNA表达不变。
2.2、常氧、低氧条件下细胞内钙离子浓度的变化
PC12细胞分别经常氧和3%或10%低氧处理24hr后,用Fluo4-AM荧光染料对细胞内钙离子进行染色,之后在共聚焦显微镜下观察。统计结果表明:3%低氧处理后,细胞内钙离子浓度明显增加;10%低氧处理后,目前的结果显示,与3%和常氧组相比,10%低氧对细胞内钙离子浓度的增加作用不是很明显。此结果尚待进一步证实,所以没有在论文中给出。
3、低氧条件下HIF-1α与L型电压依赖型钙通道之间的关系
3.1、筛选合适的HIF-1α抑制剂--棘霉素浓度并验证其对HIF-1α的抑制作用
在常氧和3%低氧条件下分别加入5nM、50nM、500nM棘霉素处理24hr和48hr进行初步筛选,结果表明:5nM、50nM、500nM棘霉素均对细胞活力有影响,48hr组影响更大;之后分别加入0.2nM、1nM、5nM和25nM棘霉素处理24hr进一步筛选,结果表明:1nM和5nM的棘霉素处理24hr是合适的;用HIF-1α的靶基因之一血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)作为阳性对照验证棘霉素的作用,结果表明:3%低氧处理24hr后,VEGF的mRNA表达明显增加,加入不同浓度棘霉素之后,VEGF的mRNA表达随棘霉素浓度增加而呈剂量依赖性下降。
鉴于在3%低氧实验中的结果,在10%低氧实验中,我们选取0.2nM、1nM、5nM和25nM棘霉素处理24hr进行筛选,结果表明:1nM和5nM的棘霉素处理24hr是合适的。10%低氧处理24hr后,VEGF的mRNA表达并未见明显上调,我们推测是由于检测时间点滞后,错过了VEGF的mRNA表达增加的峰值,在以后的实验我们会继续寻找合适的时间点。
3.2、Westernblot法检测Cav1.2和Cav1.3的蛋白表达变化
在常氧和3%低氧条件下分别加入1nM和5nM的棘霉素处理24hr,之后提取细胞内总蛋白进行Westernblot实验,结果表明:常氧和3%低氧处理后,Cav1.2和Cav1.3的蛋白表达均明显上调,经棘霉素处理后,Cav1.2和Cav1.3的蛋白表达随棘霉素浓度增加呈剂量依赖性下调。
在常氧和10%低氧条件下分别加入1nM和5nM的棘霉素处理24hr,之后提取细胞内总蛋白进行Westernblot实验,结果表明:常氧和10%低氧处理后,Cav1.2的蛋白表达有上调趋势,经棘霉素处理后,Cav1.2的蛋白表达随棘霉素浓度增加呈剂量依赖性下调。Cav1.3的蛋白表达经10%低氧处理后无明显变化,经棘霉素处理后呈剂量依赖性下调。
3.3、Real-timePCR法检测Cav1.2和Cav1-3的mRNA表达变化
在常氧和3%低氧条件下分别加入1nM和5nM的棘霉素处理24hr,之后提取细胞内RNA进行real-timePCR实验,结果表明:常氧和3%低氧处理后,Cav1.2和Cav1.3的mRNA表达均明显上调,经棘霉素处理后,Cav1.2的mRNA表达随棘霉素浓度增加呈剂量依赖性下调,但Cav1.3的mRNA表达随棘霉素浓度增加呈剂量依赖性上调。
10%低氧条件下Cav1.2和Cav1.3的mRNA表达变化暂时没有明确结果。待通过检测VEGF的表达、寻找到合适的棘霉素抑制时间点后,我们将补充这部分实验。
3.4、荧光素酶报告基因法检测HIF-1α蛋白对Cav1.2和Cav1.3基因的调控
在荧光素酶基因前面插入Cav1.2和Cav1.3基因启动子区的特定序列构建质粒并将质粒转入PC12细胞中,在常氧和3%或10%低氧条件下分别加入1nM和5nM的棘霉素处理此细胞24hr,裂解细胞,检测荧光强度,结果表明:细胞经3%或10%低氧处理后,Cav1.2基因的荧光强度均明显增加且随棘霉素浓度的增加而呈剂量依赖性下降;Cav1.3基因的荧光强度在3%低氧组明显增加,在10%低氧组保持不变,但均随棘霉素浓度的增加而呈剂量依赖性升高。
结论：
本实验主要研究低氧时HIF-1α与L型电压依赖型钙通道之间的关系。通过细胞计数和MTS法证明3%低氧抑制PC12细胞的增殖,10%低氧可促进其增殖;通过Westernblot和real-timePCR法证明3%N10%低氧处理后,HIF-1α的蛋白表达均增加,mRNA表达降低或保持不变;通过共聚焦钙成像法证明3%低氧处理后,细胞内钙离子浓度增加,10%处理后效果不太明显,待进一步证实;通过MTS法证明1nM和5nM棘霉素的用量是合适的;通过Westernblot法证明3%低氧处理后Cav1.2和Cav1.3的蛋白表达均明显上调,经棘霉素处理后,Cav1.2和Cav13的蛋白表达均随棘霉素浓度增加呈剂量依赖性下调。10%低氧处理后Cav1.2和Cav1.3的蛋白表达分别为有上升趋势和没有明显改变,棘霉素处理后,Cav1.2和Cav1.3的蛋白表达均呈剂量依赖性下调;通过荧光素酶报告基因法证明3%或10%低氧处理后,Cav1.2基因的荧光强度均明显增加且随棘霉素浓度的增加而呈剂量依赖性下降;Cav1.3基因的荧光强度在3%低氧组明显增加,在10%低氧组保持不变,但均随棘霉素浓度的增加而呈剂量依赖性升高。结果提示:抑制HIF-1α转录因子可下调Cav1.2的表达,推测Cav1.2可能是HIF-1α的下游靶基因;Cav1.3基因的表达与HIF-1α转录因子没有直接关系,可能不是HIF-1α直接调控的下游靶基因。