奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）,原产于埃及、以色列和沙特阿拉伯等地,是丽鱼科（Cichlidae）、口孵非鲫属（Oreochromis）的代表性物种,具有食性广、生长速度快和抗病性强等优点,是我国主要养殖的罗非鱼品种之一。奥利亚罗非鱼属于ZZ/ZW雌性异配的性别决定系统,在性染色体LG3上具有一个雌性性别决定位点。目前在鱼类中分离的性别决定基因均为雄性性别决定基因,分离奥利亚罗非鱼的雌性性别决定基因具有重要意义。此外,奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼的分化时间小于四百万年,却具有完全不同的性染色体和性别决定系统,是研究丽鱼性染色体和性别决定系统转换和快速进化的良好模型。更重要的是,奥利亚罗非鱼雄性个体的生长速率远快于雌性,全雄养殖具有广阔的应用前景。因此,分离奥利亚罗非鱼的雌性性别决定基因,还能促进对罗非鱼近缘种性染色体和性别决定系统转换和快速进化的研究,有利于该物种性控育种技术的发展。实验室课题组前期对基因型为ZZ的正常雄性奥利亚罗非鱼个体和基因型为WW的超雌鱼个体进行了全基因组测序,获得了高质量的ZZ和WW参考基因组,并成功定位了其位于Z和W染色体上的性别决定区间（sex determining region on Z and W chromosome,即:Z-SDR和W-SDR）。基于此,本研究对奥利亚罗非鱼孵化后5、10、20和30天的雌雄性腺进行了转录组测序,分析了在性别决定与分化早期的基因动态变化,通过基因组和转录组联合分析,筛选出了该物种的雌性性别决定候选基因banf-W,并对该基因进行了鉴定和初步功能研究。主要研究结果如下:1奥利亚罗非鱼性腺转录组测序与分析1.1性别决定与分化关键时期性腺转录组测序与比对本研究通过Illumina技术对奥利亚罗非鱼孵化后5、10、20和30天的雌雄性腺进行了转录组测序（每个时期3个重复,共计24个样本）,并将其比对到WW参考基因组上。测序数据各项指标显示各样本的测序质量良好:在产生的数据量方面,24个样本的raw reads和clean reads的平均条数分别为62157129和61042644;在错误率和GC含量方面,24个样本的平均值分别为0.03%和48.58%。各样本clean reads比对到WW参考基因组的状况良好:一致比对率均大于81.80%,平均值为83.76%;其中多重比对率的最大值为8.90%,平均值为6.25%;而不一致比对率均小于1.80%,平均值为1.28%。1.2差异表达基因分析本研究通过EdgeR软件包对各发育时期的雌雄性腺转录组进行差异表达分析。随着孵化天数的增加,差异表达基因（DEGs）的数目不断增多,且各个时期ZW雌性高表达基因（ZW-DEGs）的数目均高于ZZ雄性高表达基因（ZZ-DEGs）。具体而言,在4个时期,ZW-DEGs的数目分别为731、2657、4347和7375,而ZZDEGs的数目分别为628、919、1925和1184。奥利亚罗非鱼4个时期共同的ZWDEGs的数目为156,其分布具有明显的染色体偏好性,76个分布在性染色体LG3上;而4个时期共同的ZZ-DEGs的数目为39,其在各染色体的分布无明显的规律。这4个时期共同的ZW-DEGs和ZZ-DEGs的GO分类结果显示,这些基因主要富集到“生物过程”,包含参与性别决定与性腺发育的GO Term。1.3类固醇合成通路基因和雌雄激素受体基因的表达模式类固醇合成通路基因的总表达量随孵化时间的推移而逐步上升。其中,在雌鱼性腺中,cyp19a1a的表达均较高、且呈上升趋势,而cyp11b2的表达一直处于较低水平;在雄鱼性腺中,cyp19a1a在5 dah时表达量相对较高,但随着cyp11b2表达量的增高而迅速降低。雌激素受体基因的总表达量变化不大,其中esr2a的表达最高,esr1次之,esr2b最低。雄激素受体基因ar1和ar2的总表达量随孵化时间的推移呈上升趋势,但无明显雌雄差异。2奥利亚罗非鱼雌性性别决定候选基因的分离与鉴定2.1基因组和转录组联合筛选奥利亚罗非鱼的雌性性别决定候选基因本研究利用基因组、转录组和重测序等数据,通过一系列生物信息学分析,筛选奥利亚罗非鱼的雌性性别决定候选基因。在奥利亚罗非鱼5、10、20和30 dah的性腺均雌性高表达、且位于W-SDR的基因为22个。这22个基因均分布在约6Mb的区域内,并且其中的11个集中分布在0.4 Mb（47.0-47.4 Mb）中。分析表明,该0.4 Mb区域与基于ZZ基因组作为参考序列获得的Z-SDR中性别特异SNP显著富集的0.6 Mb区间一致,其中包含3个拷贝数目在W染色体上多于Z染色体的基因（一个banf基因和两个paics基因）。对基因组和转录组Reads的比对分析表明,这3个基因确实为W特异拷贝,但两个paics基因在性别决定关键时期的表达量极低,不足以成为奥利亚罗非鱼的雌性性别决定基因。因此,我们初步认为W染色体特异的banf基因是奥利亚罗非鱼的雌性性别决定候选基因,被命名为banf-W。2.2 banf-W的鉴定与初步的功能分析本研究通过序列比对、不同种群个体的PCR扩增验证、进化分析以及CRISPR/Cas9基因编辑对banf-W进行了鉴定和初步的功能分析。1)W特异性验证:banf-W在实验室、无锡和广州3个种群,共计108尾鱼中均满足W特异性。2)banf-W和banf-LG3的起源:banf-W为物种特异性复制,起源于banf-LG3;而banf-LG3为tilapiine支系特有复制,可能与banf2有共同的祖先。3)banf-W/banfLG3的敲除:通过CRISPR/Cas9技术在基因型为ZW的奥利亚罗非鱼中成功获得了第三个外显子整段敲除的F0阳性鱼;与对照相比,6月龄的F0突变阳性鱼的性腺发育异常,性腺萎缩且无大时相卵母细胞;HE染色和荧光免疫组化显示,F0突变阳性鱼的性腺产生大量空洞,卵母细胞数目显著减少,并产生大量易被着色的颗粒状物质;RT-PCR显示F0突变阳性鱼的cyp19a1a和foxl2的表达降低,而cyp11b2、dmrt1和amhr2的表达升高,可能发生了雄性化。综上所述,本研究通过对奥利亚罗非鱼性别决定与分化关键时期雌雄性腺转录组的测序与分析,筛选出了各时期的DEGs,发现4个时期共同的雌性高表达基因主要分布在性染色体LG3上;通过对类固醇合成通路基因和雌雄激素受体基因表达模式的分析,发现雌雄激素对奥利亚罗非鱼的性别决定与分化至关重要;基于基因组和转录组数据,通过一系列生物信息学分析,成功分离了奥利亚罗非鱼的雌性性别决定候选基因banf-W;利用CRISPR/Cas9技术敲除banf-W/banf-LG3的第三个外显子,阳性率高的F0突变鱼发生了雄性化,说明banf-W极有可能是奥利亚罗非鱼的雌性性别决定基因。本研究在理论上丰富了对鱼类雌性性别决定基因的认识,有助于解析丽鱼性染色体快速进化和性别决定系统快速转换的机制,在生产上为奥利亚罗非鱼性控育种工作的开展奠定了基础。