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膀胱肿瘤是泌尿外科最常见的肿瘤,在全世界范围内膀胱肿瘤的发病率在男性占全身肿瘤的第8位,标准发病率在男性为9.9/10万,在女性为第25位,标准发病率2.3/10万。在我国膀胱肿瘤也是泌尿外科最常见的肿瘤,膀胱移行细胞癌(Bladder Transitional CellCarcinoma,BTCC)是最常见的膀胱恶性肿瘤,占其中的92.8%。膀胱肿瘤的产生、浸润、转移和复发是一个多阶段复杂的过程,与许多癌基因的激活有关。超过50%的癌基因、原癌基因产物都具有酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)活性,RTK类癌基因,包括HER-1(EGFR)、HER-2/neu(human epidermal growth factorreceptor-2)、HER-3、HER-4等,HER-2/neu起核心作用。HER-2/neu的活化信号可以转导下游分子,介导多种生化反应,产生广泛的生物学效应,在细胞的增殖、分化、抗凋亡等过程中起重要作用。HER-2/neu过表达与多种肿瘤的发生发展、化疗耐受、放疗抵抗等相关。HER-2/neu基因在膀胱肿瘤的发生、发展中扮演何种角色仍不十分清楚。国内外现在仍未见HER-2/neu的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染BTCC细胞系的实验研究报道。我们的实验首次使用siRNA抑制膀胱癌细胞株T24中HER-2/neu基因的表达,研究HER-2/neu在膀胱癌发生、发展中的作用,探讨膀胱癌基因治疗的新途径。第一章人膀胱移行细胞癌组织中HER-2/neu表达的研究目的:从mRNA和蛋白水平研究癌基因HER-2/neu在BTCC及正常膀胱粘膜组织中的表达,结合临床病理特征研究HER-2/neu在BTCC发生发展中的作用。方法:采用RT-PCR和免疫组化从mRNA和蛋白水平检测BTCC及正常膀胱粘膜组织中HER-2/neu的表达,分析HER-2/neu表达与肿瘤发生、肿瘤临床分期、病理分级的关系。结果:BTCC中HER-2/neu mRNA表达率为57.1%,较正常膀胱粘膜组织(表达率5.0%)明显升高。随着临床分期、病理分期的升高,HER-2/neu mRNA在BTCC表达量增多。BTCC中HER-2/neu蛋白阳性率为43.1%,较正常膀胱粘膜组织(阳性率5.0%)明显升高。HER-2/neu蛋白在中低分化(Ⅱ、Ⅲ)BTCC中的阳性率明显高于高分化(Ⅰ)BTCC。HER-2/neu蛋白在浸润性(T2-T4)BTCC中的阳性率明显高于表浅性(Tis-T1)BTCC。随着病理分期的升高,HER-2/neu蛋白在BTCC阳性率增多。HER-2/neu蛋白、PCNA蛋白在BTCC中表达为正相关性,相关系数为0.336。以上差异均有显著性(P＜0.05)。BTCC中HER-2/neu mRNA、HER-2/neu蛋白表达与性别、年龄、初复发、单多发、复发前是否灌注治疗等因素无关。结论:HER-2/neu mRNA、HER-2/neu蛋白均在BTCC中表达异常增强,在BTCC发生、发展过程中起重要作用。HER-2/neu可作为诊断、判断预后、指导治疗、随访检测的指标。HER-2/neu基因可能成为BTCC新的治疗靶点。第二章针对HER-2/neu基因的siRNA表达载体的构建及鉴定目的:为研究针对HER-2/neu基因的siRNA对BTCC细胞系体外生物学行为的影响,构建插入siRNA的重组质粒pGenesil-1。方法:HER-2/neu mRNA完整序列为模板,网上在线设计两条针对CDS区的siRNA序列,BLAST同源分析证实其特异性,同时设阴性对照shHK和阳性对照shGAPDH。寡核苷酸链合成,退火磷酸化后生成双链DNA,与线性化的质粒pGenesil-1连接。转化感受态的大肠杆菌,鉴定阳性克隆,质粒酶切、测序鉴定。结果:质粒酶切鉴定可见约400bp的DNA小带,与预期相符。测序也证明重组质粒序列与设计序列完全一致。证明针对HER-2/neu基因的siRNA表达载体已构建成功。结论:成功构建了包含针对HER-2/neu基因的siRNA的重组质粒pGenesil-1,这为后期的稳定转染、抗性筛选挑取单克隆细胞株奠定了试验基础。第三章RNA干扰抑制膀胱癌细胞株T24 HER-2/neu的表达目的:为研究针对HER-2/neu基因的siRNA对BTCC细胞系体外生物学特性的影响,建立了稳定表达siRNA的BTCC细胞株T24,并探讨siRNA对HER-2/neu mRNA、HER-2/neu蛋白表达的影响。方法:将质粒P0(空质粒),质粒P1(包含shHER-2/neu-1)、质粒P2(包含shHER-2/neu-2)、质粒P3(包含shHK)、质粒P4(包含shGAPDH)瞬时转染T24细胞,分别命名为T24-P0、T24-P1、T24-P2、T24-P3、T24-P4细胞。荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR筛选出RNA干扰效果最好的重组质粒。G418筛选阳性克隆,建立稳转细胞系,RT-PCR、Western Blot检测HER-2/neu基因沉默效果。结果:T24-P1、T24-P2克隆较T24-P0克隆小,克隆生长较为缓慢,细胞的形态无明显差别。RT-PCR发现T24、空载体转染的T24-P0、阴性对照T24-P3三者目的条带亮度相当。而T24-P1、T24-P2的目的条带较前三者弱,T24-P2尤为明显。与T24相比,T24-P2细胞HER-2/neu mRNA的表达量被抑制了54.45%。T24-P2 HER-2/neu蛋白的表达比T24、T24-P0明显下降。T24 HER-2/neu蛋白表达量约为T24-P2的2.12倍,而T24、T24-P0 HER-2/neu蛋白表达量无明显差异。结论:成功构建了稳定表达针对HER-2/neu基因的siRNA的BTCC细胞株,质粒P1、P2转染对细胞HER-2/neu mRNA和蛋白的表达量均有抑制,为下一步HER-2/neu的功能研究提供了实验基础。第四章RNA干扰HER-2/neu表达对膀胱癌细胞生物学行为的影响目的:研究HER-2/neu siRNA对BTCC细胞系T24体外增殖、凋亡、迁移侵袭能力的影响及其可能机理。方法:以成功构建的稳定表达siRNA的T24-P2、T24-P0为研究对象,以未转染的T24为对照,绘制三组细胞的生长曲线比较生长差异,计算细胞倍增时间;MTT法比较三组细胞存活率的差异;流式细胞仪检测三组细胞周期和凋亡的改变;集落形成试验检验三组细胞增殖能力的差异;细胞粘附实验、划痕实验、Transwell小室检测三组细胞体外侵袭力的变化。结果:T24、T24-P0的各项指标无明显差异。与前两组相比,T24-P2生长明显缓慢,从第三天开始生长速度明显低于前两组,至对数生长期更明显,生长曲线较平缓;T24-P2细胞倍增时间30.06小时左右,延长约5小时。T24-P2存活率明显下降,最低时细胞生长被抑制了将近一半。T24-P2处于细胞前期(G0/G1期)的比例明显增加(80.13%),细胞中期(S期)的比例明显减少,凋亡细胞比例明显增多(31.08%),在G1期前出现明显的凋亡峰。T24-P2克隆速度明显减慢,细胞形态皱缩、边缘不整,出现凋亡小体,集落形成率明显低于前两组(31.70%),而集落抑制率明显高于前两组(56.93%)。T24-P2细胞粘附力明显下降。T24-P2迁移到划痕区的细胞数明显低于前两组,说明侵袭力下降。T24-P2穿过Matrigel滤膜的细胞数明显低于前两组,说明侵袭力受抑制。以上差异均具有显著性(P＜0.05)。结论:HER-2/neu干扰质粒P2稳定转染可抑制BTCC细胞株T24的体外生长,使细胞倍增时间延长,细胞周期停滞在G1/G2期,促进癌细胞凋亡,抑制癌细胞的体外粘附、迁移侵袭能力。这种抑制作用可能与siRNA下调HER-2/neu表达有关。