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拟穴青蟹(Scylla paramamosain),简称青蟹,是我国重要海水养殖蟹类之一,有很高的经济价值和营养价值。人工养殖规模不断扩大的同时也面临着诸如水质污染、病原微生物感染等问题,给养殖业造成了巨大的损失。神经肽是由神经元通过调节分泌途径和作用于神经底物而产生和释放的小蛋白物质。在体内分布广泛,含量低但活性高,可参与多种生理活动调节,近几年来其在免疫调节方面的功能也逐渐引起了研究人员的关注。神经肽与生物体内重要的先天性免疫因子抗菌肽存在相似的结构及物理特征,包括低分子量(<10 kDa)、阳离子性和两亲性等,这些特性使神经肽与微生物细胞膜上带负电荷的组分相互作用成为可能,是一种潜在的抗菌多肽。但目前针对无脊椎动物特别是青蟹神经肽在免疫防御方面的研究相对较少。本研究在实验室前期构建的青蟹早期发育阶段转录组数据库的基础之上,筛选出可能与青蟹先天免疫相关的基因神经肽FⅡ(Neuropeptide FⅡ,NPFⅡ),针对该基因表达特性、功能结构域进行细致分析,具体成果如下:1.获得了NPFⅡ基因的全长cDNA序列,揭示了其基本结构。通过RACE和序列拼接技术,得到NPFⅡ基因的全长cDNA序列,全长为551 bp,其中5’非编码区为60 bp,开放阅读框为375 bp,3’非编码区为116 bp。NPFⅡ基因共编码124个氨基酸,信号肽切割位点位于第26个(甘氨酸)和第27个(赖氨酸)氨基酸之间,成熟肽共有98个氨基酸,分子量为11.1 kDa,等电点为9.75,含有神经肽家族保守结构域PAH,二级结构及三级结构预测结果均表明NPFⅡ成熟狀主要为α-螺旋结构。2.揭示了青蟹不同发育阶段及成蟹各组织中NPFⅡ基因的表达特性。NPFⅡ基因在青蟹早期发育各阶段均有表达,在溞状幼体Ⅱ期表达量最高。NPFⅡ基因在成蟹各组织中的表达存在雌雄差异及组织特异性。NPFⅡ基因在雄性青蟹前输精管、贮精囊中表达量较高,在脑神经节、血细胞中也有一定表达,在鳃、中肠、甲壳下皮层、眼柄等组织中表达量较低,而NPFⅡ基因在雌性青蟹中几乎不表达。3.揭示了青蟹NPFⅡ基因在脂多糖LPS刺激和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后在幼体发育阶段和成蟹组织中的诱导表达特性。转录组数据分析发现,在溞状幼体Ⅰ期,LPS刺激3 h后NPFⅡ基因表达量显著下调;在仔蟹阶段,LPS刺激24 h后NPFⅡ基因表达量显著上调;而在大眼幼体阶段,LPS刺激并没有引起NPFⅡ基因表达量的变化。溶藻弧菌感染12 h后溞状幼体Ⅰ期NPFⅡ基因表达量显著上调;而溶藻弧菌感染并没有诱导NPFⅡ基因在大眼幼体阶段及仔蟹阶段表达量的变化。通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测发现,LPS刺激后3 h和48 h,NPFⅡ基因在精巢组织中的表达均显著上调;LPS刺激后12 h在肝胰腺中的表达显著上调。溶藻弧菌感染后6h,NPFⅡ基因在贮精囊中的表达显著上调;而在肝胰腺中表达无明显变化。这些结果表明神经肽NPFⅡ基因参与了青蟹对病原菌的免疫应答过程。迄今尚未见海洋甲壳动物神经肽NPFⅡ的相关免疫特性的报道。4.获得了青蟹NPFⅡ成熟肽并发现其对多种细菌具有体外结合活性和凝集作用。构建了真核表达载体及原核表达载体,并利用原核表达系统获得了成熟肽表达产物,研究发现该重组蛋白可识别并结合细菌细胞壁各组分如LPS、LTA、PGN、glucan,对多种细菌如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、溶藻弧菌、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、毕赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115),具有较强的结合作用,且对哈氏弧菌、河流弧菌和溶藻弧菌三种弧菌具有凝集作用。5.确定了NPFⅡ高抗菌活性的功能结构域Sp-NPFin。根据NPFⅡ功能结构域预测及二级结构预测分析结果,截取NPFⅡ成熟肽第29个(精氨酸)至第73个(丝氨酸)氨基酸进行化学合成,经体外抗菌试验证实该合成多肽具有较高的抗菌活性,因而确定了该序列片段为NPFⅡ活性结构域,并命名为Sp-NPFin。Sp-NPFin分子量为5.12 kDa,净电荷为+7,疏水性28%,为α螺旋结构。6.发现了Sp-NPFin具有广谱抗菌特性,能够高效地抗细菌和真菌。抗菌实验结果表明Sp-NPFin对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebauterium glumicumm),革兰氏阴性菌如大肠埃希氏菌(Escherichia col)、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)都有较强的抑菌和杀菌作用,对霉菌如尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、腐皮镰孢(Fusarium solani)有较强的抑菌和杀菌作用,对霉菌如禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、赭曲霉(AAspergillus ochhraceus)有抑菌作用但无杀菌活性。Sp-NPFin对细菌的抗菌活性具有较好的热稳定性,但容易受Na+影响。杀菌动力学曲线显示Sp-NPFin与铜绿假单胞菌共孵120 min时杀菌指数达到100%,与金黄色葡萄球菌共孵30 min即可达到100%杀菌指数。此外,Sp-NPFin对正常拟穴青蟹血细胞及受测正常哺乳细胞(人肾上皮细胞和人正常肝细胞)不具有细胞毒性,对受测癌细胞(人肝癌细胞和人大细胞肺癌细胞)也无明显抗肿瘤活性。上述结果表明Sp-NPFin具有广谱抗细菌和抗真菌活性,且作用快、效果好。7.初步阐明了 Sp-NPFin的抗菌机制。选取了具有较强抗菌效果的代表性微生物革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌)和真菌(黑曲霉和尖孢镰孢),通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察Sp-NPFin作用后对这四种微生物的细胞完整性及超微结构的影响,发现Sp-NPFin处理后受测菌的细胞形态都发生了明显变化,且细胞破损,内容物大量泄露;微生物表面多糖结合实验显示Sp-NPFin能识别并结合LPS、LTA、PGN、glucan,且通过共聚焦激光扫描显微镜观察发现Sp-NPFin可定位到微生物表面。研究结果初步表明,Sp-NPFin可能结合到细菌表面,与细胞膜相互作用并改变其通透性,导致内容物泄露,细胞裂解死亡。但关于抗菌多肽Sp-NPFin具体的抗菌机制有待进一步地探讨。该研究成果表明Sp-NPFin具有光谱抗细菌和抗真菌活性,在抗菌药物开发应用领域具有较好的潜在的应用价值。