目的我们应用慢病毒(lentivirus,LV)介导的RNA干扰技术敲低骨肉瘤中CCDC132的表达,观察CCDC132对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响;揭示CCDC132在骨肉瘤发病中的功能作用;为CCDC132成为骨肉瘤临床治疗靶点的可能性提供前期可靠的实验依据,进一步证实CCDC132对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。方法1.首先运用实时荧光PCR技术测定各细胞株Saos-2、U-2OS、MG-63、HOS中CCDC132基因的表达情况;再利用预先设计好的CCDC132基因敲减组慢病毒和阴性对照组慢病毒感染细胞U-2OS,使用实时荧光PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)检测U-2OS细胞株中CCDC132基因的蛋白表达量并计算敲减效率;感染293T细胞后,采用蛋白质印迹法(Western blot,WB)验证基因靶点的有效性并挑选最佳靶点。2.用预先设计好的CCDC132基因敲减组慢病毒和阴性对照组慢病毒分别感染细胞U-2OS,利用celigo细胞计数来分析CCDC132表达对骨肉瘤细胞系U-2OS细胞生长增殖的影响;采用PI-FACS细胞周期实验检测CCDC132对细胞系U-2OS细胞周期的影响;利用Annexin V-APC单染法测定CCDC132基因表达对细胞凋亡的影响;通过MTT实验体外检测CCDC132表达对细胞活力的影响。结果1.从实时定量PCR结果可以看出,在Saos-2、U-2OS、MG-63、HOS等4株人骨肉瘤细胞均高丰度表达CCDC132基因,且目的基因在U-2OS中的表达丰度最高。2.成功感染目的细胞U-2OS,从q PCR结果可以看出,经sh RNA慢病毒感染后,实验组U-2OS细胞中CCDC132基因在m RNA水平的表达量受到抑制(p<0.05),敲减效率达到77.9%。3.目的基因敲低组慢病毒和阴性对照组慢病毒成功感染293T细胞后,从Western Blot结果可以看出,该靶点序列对目的基因的外源表达有敲减作用,因而是有效靶点。4.Celigo细胞计数实验显示:敲减组细胞系U-2OS增殖速率受到显著抑制,可见CCDC132在骨肉瘤细胞的增殖过程中起到促进作用。5.PI-FACS细胞周期实验检测:与对照组相比,处于G1期的sh CCDC132组细胞数明显减少(P<0.05),处于S期的细胞数减少(P<0.05),处于G2/M期的细胞数增多(P<0.05);可见CCDC132基因与U-2OS细胞的周期分布显著相关。6.Annexin V-APC单染法细胞计数实验结果显示:相比对照组,sh CCDC132组细胞凋亡数增多(P<0.05)。提示CCDC132基因与U-2OS细胞的凋亡显著相关。7.MTT检测结果表明:相比sh Ctrl组,sh CCDC132组细胞增殖明显减缓,细胞活力明显下降。提示CDCC132基因与U-2OS细胞增殖能力显著相关。结论1.CCDC132在OS细胞中高表达,尤其在U-2OS中,CCDC132表达丰度明显高于其他细胞系。2.CCDC132是一个有效靶点,通过慢病毒介导的RNA干扰后,骨肉瘤细胞的表达明显抑制,将来可能为骨肉瘤的靶向治疗提供方向。3.通过细胞学功能测定,我们可得知:CCDC132的表达可促进细胞的增殖,增强细胞增殖的效率,引起细胞周期停滞并促进凋亡。