论文部分内容阅读
研究背景：真菌性角膜炎是一种严重的眼部感染性疾病,近年来其发病率不断上升。真菌感染引起角膜溃疡是导致失明的重要原因。角膜细胞是角膜天然免疫的一道重要防线,角膜细胞并非传统意义的免疫细胞,但细胞上的某些受体可以快速识别真菌并抵御其入侵,发挥免疫作用。胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoetin,TSLP),是一种新型的与Th2介导的过敏性疾病相关联的细胞因子。已有研究表明角膜细胞通过TLR/NFκB信号通路合成并分泌TSLP,但TSLP是否可以直接作用于角膜细胞并在角膜细胞抗真菌免疫中发挥作用及其作用机制尚无具体研究。目的：研究TSLP/TSLPR/STAT5和TLR2/MyD88/NFκB-p65信号通路在人角膜上皮细胞抗烟曲霉菌感染中的相互作用。方法：将培养的人永生化角膜上皮细胞(telomerase-immortalized human corneal epithelial cells, THCEs)以1×105个/孔的密度种植到六孔板上,用106个/ml的2040μm烟曲霉菌菌丝片段刺激液刺激人永生化角膜上皮细胞,刺激后不同时间点(30min,1 h,3h,6h,12h,24h,48h)收细胞,RT-PCR检测信号通路分子TSLP受体(TSLP receptor, TSLPR)、IL-7Rα;刺激后12h收细胞, RT-PCR和ELISA检测TSLP的表达,Western Blot检测TSLPR、p-STAT5和STAT5蛋白表达；刺激后12h细胞免疫荧光检测转录因子p-STAT5向细胞核内的转移。用10 mg/ml的酵母聚糖刺激人永生化角膜上皮细胞,刺激后不同时间点(1h,3h,6h,12h,24h,48h)收取细胞,RT-PCR检测信号通路分子TSLPR;刺激后12h收细胞和细胞上清液,RT-PCR和ELISA检测TSLP的表达；刺激后48h收细胞,Western Blot检测TSLPR、p-STAT5和STAT5蛋白表达。单克隆抗体封闭人永生化角膜上皮绌胞表面TLR2受体,烟曲霉菌刺激12h收细胞和细胞上清液,RT-PCR和ELISA检测TSLP的表达,Western Blot检测TSLPR、p-STAT5和STAT5蛋白表达；人重组TSLP蛋白刺激人永生化角膜上皮细胞,刺激后不同时间点(30min,lh,3h,6h)收取细胞,RT-PCR检测MyD88；刺激后3h,Western Blot检测NFκB-p65的蛋白表达。siRNA敲减TSLP后,烟曲霉菌刺激人永生化角膜上皮细胞,刺激后不同时间点(30min,lh,3h,6h)收取细胞,RT-PCR检测MyD88；刺激后3h, Western Blot检测NFκB-p65的蛋白表达。结果：烟曲霉菌菌丝刺激人永生化角膜上皮细胞后,TSLPR和p-STAT5表达增多。酵母聚糖刺激人永生化角膜上皮细胞后,TSLPR和p-STAT5的表达也增多；TLR2单克隆抗体封闭TLR2后,炯曲霉菌活化的TSLP下游信号通路分予TSLPR和p-STAT5的表达减少。人重组TSLP蛋白促进角膜上皮细胞中TLR2下游信号分子MyD88和NFKB-p65的表达,siRNA敲减TSLP后炯曲霉菌诱导的MyD88和NFKB-p65的表达减少。结论：TSLP/TSLPR/STAT5信号通路存角膜上皮细胞抗烟曲霉菌感染中发挥重要作用,并且在此过程中TLR2下游信号分子上调TSLP/TSLPR/STAT5信号通路,TSLP下游信号分子上调TLR2/MyD88/NFKB-p65信号通路。