增生性瘢痕（hypertrophic Scar,HS）是皮肤受到手术、烧伤及创伤后最常见的并发症,是皮肤损伤后组织异常修复所导致的一种病理性瘢痕,是以成纤维细胞过度增殖,迁移和侵袭并抑制其凋亡,同时细胞外基质成分在组织中过度沉积,主要以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的沉积物又难以被机体吸收或重塑的一种病理状态。HS临床表现有局部变硬增厚,表面紫红或潮红,并伴有不同程度的瘙痒,刺痛,早期易形成水泡,导致瘢痕溃疡,色素沉着,不仅影响美观,严重者甚至会出现瘢痕挛缩畸形,极大地影响患者生活质量及身心健康。但其具体分子生物学水平及病理生理机制尚不明确,已成为临床治疗的难点。蛋白质作为生命功能的执行者,在疾病的发生发展过程中具有举足轻重的地位。蛋白质组学是一门全方位研究生命结构功能、生理功能及生命活动规律的新兴学科,已成为后基因组时代研究的重要内容,在很多领域得到广泛关注。蛋白质翻译后修饰组学是蛋白质组学研究的一个重要分支,不仅在蛋白质的多样性方面发挥重要作用,而且对于调控复杂的生理学过程中也起到至关重要的功能,它能更好地揭示生命现象的本质与规律。赖氨酸乙酰化修饰（Lysine acety lation,KAc）是一种常见的翻译后修饰,可调节多种细胞过程,并与许多疾病相关。组蛋白乙酰化可以激活IV型胶原,促进成纤维细胞在肺癌中的迁移。I型胶原通过乙酰化促进前脂肪细胞的迁移,前脂肪细胞的过度迁移可能导致异常发育和纤维化相关疾病,如增生性瘢痕。此外,赖氨酸琥珀酸化修饰（Lysine succinylation,KSuc）是一种新发现的翻译后修饰。与赖氨酸乙酰化相比,赖氨酸琥珀酰化可以通过将赖氨酸的电荷从+1改变为-1,并引入具有更大结构的基团来引起蛋白质性质的变化。KSuc可参与糖代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、活性氧清除及酮体合成等多种生命活动,主要是通过调控基因表达和蛋白酶活性来控制,其异常与神经系统疾病、心脏代谢疾病、肝脏代谢疾病、肿瘤等多种疾病的发生和发展密切相关。本项目拟研究增生性瘢痕蛋白质组学和修饰组学的变化,发现蛋白质的病理变化和蛋白质翻译后修饰的变化,有助于揭示HS的发生和发展过程中的具体分子机制和有利于开发新的治疗药物,从而寻找到增生性瘢痕的诊断标志物和防治方法的突破口。本课题由以下四部分组成。第一章赖氨酸乙酰化在增生性瘢痕与正常皮肤中的差异修饰初探目的:探索赖氨酸乙酰化在增生性瘢痕与正常皮肤中的差异修饰。方法:通过使用蛋白质修饰组学技术来研究HS中的乙酰化蛋白表达谱。结果:发现KAc在HS和正常皮肤中的存在,并且在HS中KAc的水平高于正常皮肤。总共鉴定到259个蛋白质上的556个KAc修饰位点,其中可定量的有88个KAc蛋白和175个KAc位点。与正常皮肤相比,HS中发现50个KAc蛋白和92个KAc位点上调,10个KAc蛋白和13个KAc位点下调。HS相关信号通路中14个差异乙酰化蛋白形成了一个PPI网络,包括DCN（TGF-β/Smad信号通路）、tenascin-X（TNXB,PI3k-AKT信号通路）、胶原α-3（VI）链（COL6A3,PI3k-AKT信号通路）、COL6A2（PI3k-AKT信号通路）、热休克蛋白β-1（HSPB1,MAPK信号通路）、脂肪酸合成酶（FASN,MAPK信号通路）、TF（MAPK信号通路）、COL1A1（Relaxin信号通路）、GAPDH（HIF-1信号通路）、二磷酸醛缩酶a（ALDOA,PI3k-AKT信号通路、HIF-1信号通路）,α烯醇化酶（ENO1,HIF-1信号通路）,S100A9（IL-17信号通路）,14-3-3蛋白sigma（SFN,p53信号通路）。结论:KAc在HS和正常皮肤中的存在差异修饰,且与HS相关信号通路中14个差异乙酰化蛋白有关联,这为KAc在HS的作用机制研究提供了新方向。第二章赖氨酸琥珀酰化在增生性瘢痕与正常皮肤中的初步研究目的:探索赖氨酸琥珀酰化在增生性瘢痕与正常皮肤中的差异修饰。方法:使用蛋白修饰组学技术来研究HS中的琥珀酰化蛋白表达谱,并采用PRM验证差异修饰蛋白。结果:总共鉴定到了79个KSuc修饰蛋白和159个KSuc修饰位点。我们分析了HS和正常皮肤之间的差异修饰蛋白和位点,总共定量了33个KSuc蛋白和53个KSuc位点。与正常皮肤相比,HS中29个KSuc蛋白质和38个KSuc位点上调1.5倍以上,但无下调KSuc蛋白和位点。这些被KSuc修饰的蛋白主要位于线粒体、细胞外成分和细胞质以及细胞核,这可能与能量代谢或胶原合成有关。选取TGF-β/Smad、PI3k-AKT、MAPK这三条经典信号通路中的8个蛋白（4个差异琥珀酰化修饰蛋白（COL6A2,COL1A1,DCN和TF）和4个为感兴趣的琥珀酰化修饰蛋白（TGFB1、ACTA2、HSPB1和COL6A3））进行KSuc的PRM验证,结果证实4个差异琥珀酰化修饰蛋白的PRM结果与蛋白质组数据一致,4个感兴趣的琥珀酰化修饰蛋白符合预期。结论:首次证实KSuc在HS和正常皮肤中的存在差异修饰,TGF-β/Smad、PI3k-AKT、MAPK这三条经典信号通路中的8个蛋白（TGFB1、ACTA2、DCN、HSPB1、TF、COL6A3、COL6A2和COL3A1）发生了KSuc,这为KSuc在HS的功能作用研究奠定了理论基础。第三章增生性瘢痕中赖氨酸乙酰化和琥珀酰化共修饰组学分析目的:增生性瘢痕中赖氨酸乙酰化和琥珀酰化crosstalk分析。方法:利用生物信息学方法分析增生性瘢痕中乙酰化和琥珀酰化共修饰情况。结果:在HS中,发现48个蛋白和52个位点同时被KAc和KSuc修饰。这些重叠修饰蛋白和重叠修饰位点的蛋白质主要位于线粒体、细胞外成分、细胞质和细胞核中。与HS相关的TGF-β/Smad、PI3k-AKT、MAPK、relaxin、HIF-1、AGE-RAGE、IL-17等信号通路中我们发现DCN、COL6A2、TF、COL1A1、GAPDH、COL3A1、S100A9和S100A8,这8个蛋白同时发生赖氨酸乙酰化和琥珀酰化修饰。结论:在HS中KAc和KSuc的crosstalk分析发现了重叠修饰蛋白和重叠修饰位点,加深对PTMs在HS作用机制的理解和认识,为后续研究HS提供了新思路。第四章赖氨酸乙酰化和琥珀酰化修饰在人皮肤成纤维细胞中的功能探索目的:体外细胞水平探讨KAc和KSuc在人成纤维细胞中的功能。方法:乙酸钠或琥珀酸二钠处理人皮肤成纤维细胞后,采用CCK8、WesternBlot和q RT-PCR检测细胞增殖、KAc、KSu c和人皮肤成纤维细胞纤维化指标α-SMA、COL1、COL3变化。结果:乙酸钠和琥珀酸二钠均可显著促进人皮肤成纤维细胞的增殖以及提高人皮肤成纤维细胞的KAc和KSuc水平。在人皮肤成纤维细胞中,乙酸钠显著上调α-SMA、COL1和COL3的m RNA水平,而琥珀酸二钠不影响这些基因的m RNA水平。乙酸钠和琥珀酸二钠均显著上调α-SMA、COL1和COL3的蛋白水平。结论:KAc和KSuc可促进人成纤维细胞增殖,这为后续研究KAc和KSuc在HS中的功能研究提供实验依据。