论文部分内容阅读
N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)是一种天然存在的碳水化合物,附着在细胞表面和可溶性蛋白质上的糖链末端。Neu5Ac是合成抗流感药物扎那米韦的前体,具有重要的生物学功能和医药价值。全细胞催化合成Neu5Ac的方法因其操作简便,成本低廉等优点,目前被认为是最适合合成Neu5Ac的方法。为探索Neu5Ac全细胞催化工艺,我们首先选取了5种不同的异构酶基因克隆到表达载体pET30a(+)上异源表达,摸索表达条件,选出质粒pLS3704A,其上克隆了来源于人肠道细菌Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482的异构酶基因BT0453,SDS-PAGE显示BT0453约有50%的可溶性,超过其他的蛋白。我们还尝试了在阿拉伯糖、鼠李糖表达系统中表达BT0453,但表达效果不理想。大肠杆菌来源的醛缩酶NanA几乎全部可溶。其次,将BT0453与nanA融合克隆到同一质粒中,得到pLS3706A。为了将BT0453和nanA敲入至基因组中,我们采用了重组工程和I-SceI介导的双链断裂修复的方法,构建了质粒pLS3724,并最终获得了BT0453及nanA基因组敲入菌株LS3702。第三,将有利于Neu5Ac生成的基因glmS*72整合到基因组上同时将nagABE基因敲除得到了菌株LS3704,将ScGNA1基因整合到基因组中同时敲除manXYZ基因得到菌株LS3706,将另外一个拷贝的ScGNA1基因再次整合到基因组上同时将fucIK基因敲除得到了菌株LS3708。在以上工作的基础上将双质粒系统pLS3704A、pLS3705A,单质粒系统pLS3706A、基因组系统LS2402、LS3702,和基因整合菌株LS3704、LS3706、LS3708,以GlcNAc和丙酮酸钠为底物,全细胞催化生成Neu5Ac,结果双质粒系统pLS3704A偶联pLS3705A最大摩尔转化率可达到50.2%,基因组敲入菌株LS3702转化的最快,摩尔转化率最高达到47.6%,单质粒pLS3706A和基因组敲入菌株LS2402的摩尔转化率为47.7%。但LS3704、LS3706、LS3708未能催化出Neu5Ac。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032及其衍生菌株是重要的用于生产氨基酸及其衍生物的工业菌株,对其基因组的改造将有助于研究基因表征和蛋白质功能,但是目前的基因组改造策略仍存在效率以及操作繁琐低等问题,通过归巢内切酶I-SceⅠ介导的基因敲除可能简化操作。通过设计引物,PCR扩增得到同源臂,克隆到T载体,再将同源片段连接到自杀质粒载体上,最终得到敲除crt操纵元的质粒pLS3726,基因敲除CGP1的质粒pLS3728,敲除CGP2的质粒pLS3730,敲除CGP3的质粒pLS3732以及dkan敲入质粒pLS3735。重组后通过抗性筛选得到正确的整合菌株,整合菌株只需加入IPTG诱导,筛选所得无抗菌株,再通过PCR和测序验证即可筛选出目的菌株,无需通过SacB等改变培养基的方法进行筛选。实验结果最终得到敲除crt操纵元的菌株LS3752,敲除CGP1的菌株LS3754,dkan敲入菌株LS3760,CGP2和CGP3的基因敲除仍在进行之中。以LS3760为基础,比较寡核苷酸前导链和滞后链对dkan恢复为kan的点突变的效率,结果显示滞后链效率高于前导链。我们还发现寡核苷酸的量与重组效率呈正相关。在寡核苷酸的5’端含4个磷硫酰连接和寡核苷酸多个位点突变方面也做了初步尝试,但最后多个位点的突变得到的菌株测序发现有错误的突变。