【摘 要】
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腹泻是影响仔猪成活率的关键,细菌性腹泻主要是由猪源性产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）等引起的。而大肠杆菌产生的耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin,STp）是其引起仔猪腹泻的主要致病因子。STp可损伤肠上皮结构和功能,但其机制尚不清楚。为了研究STp破坏肠上皮完整性的机制,试验选取4周龄左右的雄性小鼠12只,随机分
【基金项目】
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十三五国家重点研发计划项目（2017YFD0500501）； 国家自然科学基金面上项目（31872389）； 广州市科技计划项目（201807010001）；
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腹泻是影响仔猪成活率的关键,细菌性腹泻主要是由猪源性产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）等引起的。而大肠杆菌产生的耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin,STp）是其引起仔猪腹泻的主要致病因子。STp可损伤肠上皮结构和功能,但其机制尚不清楚。为了研究STp破坏肠上皮完整性的机制,试验选取4周龄左右的雄性小鼠12只,随机分为对照组（CON）和耐热肠毒素组（STp）,每组6个重复,每个重复1只小鼠。其中STp组灌服5.0 mg/kg BW耐热肠毒素,CON组灌服同体积的PBS。灌服6 h后处死小鼠,采集肠道组织,检测肠道结构和屏障功能相关指标,分离小鼠空肠隐窝进行体外培养,统计肠道干细胞扩增为类肠团的生成效率,采用石蜡切片HE染色和扫描电镜观察小鼠空肠形态,ELISA检测空肠组织中二胺氧化酶（Diamine oxidase,DAO）,Western blotting检测空肠及其隐窝紧密连接蛋白质表达,Wes检测类肠团中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白质表达。其次,以猪空肠上皮细胞系IPEC-J2和小鼠结肠上皮细胞系CMT-93为模型,运用MTT、细胞计数和Ed U法检测400 ng/m L STp对细胞增殖的影响,在差异时间点利用、流式细胞术、transwell、免疫荧光、Western blotting检测细胞凋亡执行者（Caspase-3）、增殖标志（PCNA和Ki67）、细胞屏障和Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白质的表达。此外,用25 ng/m L R-spondin1缓解STp诱导肠上皮细胞的损伤。最后,以7日龄二元杂仔猪空肠隐窝培养的类肠团为模型,研究STp对干细胞扩增的效率和Wnt/β-catenin信号通路的影响。试验结果如下:（1）STp破坏小鼠肠道结构,显著降低单位长度空肠重量和绒毛高度,以及空肠绒毛上Mucin2+和隐窝中Lysozyme+细胞数量（P<0.05）;STp损伤肠道屏障功能,显著降低空肠跨膜电阻值、空肠和隐窝中ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白质表达（P<0.05）;STp抑制Wnt/β-catenin信号通路,降低类肠团β-catenin、Lgr5（leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5）和PCNA（proliferation cell nuclear antigen）蛋白质表达（P<0.05）。（2）400 ng/m L STp处理48 h显著抑制IPEC-J2和CMT-93细胞增殖,降低Ed U+、Ki67+细胞比例和PCNA蛋白质表达（P<0.05）;诱导细胞凋亡,显著增加凋亡细胞比例和Caspase-3蛋白质表达（P<0.05）;破坏肠上皮细胞屏障,降低TEER值和紧密连接蛋白质ZO-1、Occludin和Claudin-1表达（P<0.05）;抑制Wnt/β-catenin信号通路表达,上调GSK-3β（glycogen synthase kinase 3β）蛋白质表达（P<0.05）,降低β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白质表达（P<0.05）;R-spondin 1处理72 h,逆转STp对Wnt/β-catenin的抑制作用,促进肠上皮细胞增殖。（3）400 ng/m L STp处理干细胞24 h,类肠团变为球形,出芽指数显著降低（P<0.05）。STp显著降低β-catenin、Lgr5、PCNA和紧密连接蛋白质ZO-1、Claudin-1的表达水平（P<0.05）,增加凋亡类肠团的比例和Caspase-3蛋白质的表达（P<0.05）。以上结果说明,STp通过下调Wnt/β-catenin信号通路表达,抑制肠道干细胞活性,降低干细胞扩增成为类肠团的效率,阻碍肠上皮细胞增殖,促进细胞凋亡,最终导致肠上皮屏障功能受损。
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