研究目的:通过对纤维蛋白胶/β-磷酸三钙/磷酸二氢钙复合人工骨材料进行动物体内实验,探讨纤维蛋白胶/β-磷酸三钙/磷酸二氢钙复合人工骨材料修复骨缺损的能力及作为人工骨修复替代材料的可行性,指导临床用于骨缺损的修复。研究方法:[1]动物骨缺损模型的建立1动物骨缺损模型的建立选用健康成熟的新西兰大白兔22只,在双侧股骨外侧髁部建立骨缺损模型,用环钻分别钻取直径4mm、孔深8mm的柱状圆洞,采用随机自身对照的实验研究,随机分为两组:将纤维蛋白胶/β-磷酸三钙/磷酸二氢钙复合人工骨材料随机植入一侧兔下肢的骨缺损处,作为实验组;另一侧兔下肢骨缺损以β-磷酸三钙/磷酸二氢钙骨水泥植入,作为对照组。2植入物的准备与植入实验组将β-磷酸三钙/磷酸二氢钙骨水泥与柠檬酸溶液(500mmol/L)按固液比1g∶0.3ml混合,再用双腔注射器同时加入相同体积的纤维蛋白胶溶液和凝血酶溶液。磷酸钙骨水泥与纤维蛋白胶按凝固后体积比2∶1的比例均匀混合组成复合型磷酸钙骨水泥,用专用注射器注入骨缺损孔洞内并使复合型骨水泥外溢,同时加压固定10分钟直至硬化,对照组同样将β-磷酸三钙/磷酸二氢钙骨水泥与柠檬酸按固液比1g∶0.3ml混合,直接用专用注射器注入骨缺损孔洞内并使骨水泥外溢,同时加压固定10分钟直至硬化。[2]人工骨-骨界面力学性能研究1力学标本的制备取材时间分别在术后2、4、8和12周(n=4)。实验动物以空气栓塞方法处死。将股骨髁标本锯下后用双层生理盐水纱布包裹,置入聚乙烯袋内,在-20℃冰箱内保存备用。力学测试前24小时,将置于-20℃冰箱中保存的股骨髁标本取出,室温下自然复温解冻,再将标本用牙托粉固定准备进行力学测试。2力学标本的生物力学测试将准备好的力学标本置于测试机的底托上并固定。应用推出实验的原理,将直径4.0mm的顶冲头垂直对准植入体并与植入体长轴成一条直线,以0.5mm/min的加载速度逐渐加压,设定行程位移为15mm,记录即时加载曲线,其峰值代表界面最大剪切力;同时测量皮质骨与植入体接触的厚度(h)和植入体的直径(d)。用以下公式计算推出实验的剪切强度:最大剪切强度(MPa)=最大剪切力(N)/骨与植入体接触面积(mm~2);骨与植入体的接触面积:S=π×d×h。测试时将每组样本均按上述方法进行测试,得出剪切强度通过SPSS13.0软件包进行统计学分析。[3]人工骨-骨界面的超微结构特征1动物骨缺损标本的肉眼观察于术后2、4、8和12周分别处死新西兰兔,取双侧股骨髁标本,清除植入物表面纤维软组织,肉眼观察骨水泥表面的骨长入情况。2组织病理学观察将双侧股骨髁骨缺损标本修整后,将其置入固定脱钙液中浸泡24小时,待脱钙完全后,自来水连续冲洗3小时,直至残留硝酸冲净为止,然后将标本依次脱水、透明、石蜡包埋后,切片机沿平行于股骨髁纵轴的方向切片(片厚5μm),烘干后脱蜡,常规苏木素-伊红染色法染色,树胶封固。在OlympusBH2型光学显微镜下观察骨与磷酸钙骨水泥及骨与复合型磷酸钙骨水泥的界面结合情况及两种骨水泥的降解情况,材料周围组织内有无成骨细胞、破骨细胞及炎性细胞浸润等。3扫描电镜观察将固定脱钙后的股骨髁标本沿骨水泥植入方向剖开,修整成合适大小(2×5×5mm~3)后,磷酸缓冲液逐级浸泡,0.9%生理盐水反复冲洗,超声波振荡器内洗涤5-10分钟,30%-100%乙醇逐级脱水,临界点干燥,真空喷金,视野选定组织材料交界处,日立S-3000N型扫描电镜下观察材料与骨的界面结合情况、材料的降解及新骨生成情况等。研究结果:1实验动物数量分析:实验所选用新西兰大白兔22只(16只用于生物力学测试,6只用于结构特征检测),无一只死亡,全部进入实验结果分析。2大体观察:大部分动物术后活动进食情况基本正常,精神状态无明显变化,未见瘫痪、惊厥、呼吸抑制等不良情况。手术区均有不同程度肿胀,1周后消失,创口均无感染。材料植入部位未观察到明显的动物机体排斥反应,未见材料裸露,软组织覆盖良好,伤口愈合良好。2周时植入物外观体积和形态无明显变化,骨水泥与宿主骨之间无明显间隙,两组材料植入物均已与宿主骨纤维连接,骨水泥表面被纤维组织包裹,植入区均未见明显骨质结合,实验组植入骨水泥表面颜色由白色变成浅黄色,对照组骨水泥表面颜色仍为白色;4-8周时骨水泥被致密纤维组织包裹,表面有新生骨突起,外形不规则,表面粗糙,颜色变成红色,两组骨水泥外观区别不明显;12周时骨水泥植入体与周围骨质均匀结合,缺损区内骨外形光滑、塑型好,类似自体骨。复合型磷酸钙骨水泥植入区质地较硬,而单纯磷酸钙骨水泥植入区质地较软。3生物力学测定术后2、4、8、12周各组的推出试验所得检测结果采用SPSS13.0版软件包进行析因设计方差分析,从统计学分析结果可以得出,不同的水泥组间有显著差异(F=106.256,P=0.000),实验组复合型骨水泥最大剪切强度((?)=3.312)强于对照组骨水泥((?)=2.672);同组水泥中不同时间点的最大剪切强度有显著性差异(F=1290.166,P=0.000);结合图的多重比较结果可以看出,随着时间的增加,不同的水泥组间有显著差异(F=198.274,P=0.000)。实验组复合型骨水泥最大剪切强度2周(0.511±0.080MPa)和4周(0.938±0.067MPa)时低于对照组骨水泥。但从植入后4周到8周逐渐增强,特别是8周(5.367±0.182MPa)到12周(6.432±0.119MPa)期间,抗剪强度显著高于对照组(P＜0.05)。4组织病理学观察实验组:术后2周骨水泥疏松多孔,材料周边已少许降解,胶原纤维在材料内较多见。骨缺损区内结缔组织增生,较多成纤维细胞和间充质细胞向骨缺损区生长,可见破骨细胞活动;4周时形成新生幼稚骨小梁,胶原纤维已部分吸收,在骨-骨水泥交界处形成明显的降解带,微血管增生;8周时骨水泥降解吸收达高峰,骨水泥被大量条带状的新生骨小梁分割并包绕成块状。骨小梁较多、粗大,排列不规则,骨生长旺盛,新骨组织处于改建区,新生骨量明显增加;12周时,骨水泥降解基本完成,残余的少量骨水泥呈空泡样,缺损处基本上是骨小梁,骨小梁明显增粗成片状,新生骨基本完成了向板层骨改建。对照组:2周时可见骨缺损处未被吸收的磷酸钙骨水泥,骨生长不旺盛;4周时材料周围骨髓组织大致正常,见脂肪空泡及骨髓细胞,有纤维细胞聚集,材料与周围骨及骨髓组织接触较紧密,见少量软骨增生未见新生骨形成;8周时骨水泥部分降解,骨一骨水泥交界部位结合不紧密,可见纤维样组织条带,有软骨增生及新骨形成;12周时材料中有新生骨小梁形成及部分骨化,磷酸钙骨水泥仍有残留。5扫描电镜观察实验组:8周时,新生骨组织自宿主骨边缘向复合型磷酸钙骨水泥植块内长入,植块内充满了骨组织。宿主骨与移植物间界面可见两侧骨质致密度不同,界面两侧骨小梁、骨纤维排列不同,宿主侧排列整齐,移植侧排列不规整,新生骨板层在植块内间隙穿行,将磷酸钙骨水泥颗粒分隔成窝群并包绕;植块中的纤维蛋白胶已降解,呈现大小不一的孔隙;骨板层内可见新生的哈佛氏系统。12周时,新生骨组织改建为胶原纤维束密实、钙化程度高的板层骨组织,宿主骨与移植物间界面消失,两侧骨纤维、骨基质形态排列大致相同。对照组:12周时宿主骨与骨水泥骨界面模糊,界面两侧骨小梁、骨纤维排列不同,骨样组织及编织骨围绕磷酸钙骨水泥颗粒,骨样组织将磷酸钙骨水泥颗粒埋于其中,未见板层骨生成。结论:1.磷酸钙复合纤维蛋白胶人工骨复合材料组比磷酸钙骨水泥组能更有效地修复骨缺损;生物力学测定证明不同的水泥组间有显著差异,随着时间的延长,实验组复合型骨水泥抗剪切强度显著强于对照组单纯骨水泥抗剪强度。2.组织学电镜观察显示磷酸钙复合纤维蛋白胶人工骨复合材料组成骨性能优于磷酸钙骨水泥组;实验证实,磷酸钙复合纤维蛋白胶人工骨复合材料具有良好的可塑形性、可降解性、骨诱导性和生物相容性。3.该可注射性新型复合纤维蛋白胶的磷酸钙人工骨材料具有良好的骨传导能力、力学特性及生物相容性,有望成为骨组织工程中修复骨缺损的理想材料。