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人滋养层细胞表面抗原-2(trophoblast cell-surface antigens2, Trop-2)亦称TACSTD2、GA733-1、EGP-1,定位于1p32区域,是无内含子基因,所编码的产物含有323个氨基酸、35.7kDa的蛋白质。它是一个单次跨膜糖蛋白,在正常上皮组织中很少表达或不表达,但在滋养细胞及多种上皮癌中高表达。研究表明,Trop-2与多种肿瘤的侵袭行为密切相关,具有促进肿瘤细胞侵袭和转移的功能。因此,Trop-2可能成为一种新的肿瘤预后标志物,并在肿瘤的靶向治疗中成为潜在靶点。随着现代医学发展和分子生物学技术的提高,人们逐渐从分子、基因水平对肿瘤的发病机制有了了解,肿瘤的靶向治疗技术应运而生,成为近年肿瘤治疗领域研究的热点。肿瘤靶向治疗技术不断完善,多种治疗手段应用于肿瘤的治疗,并在临床实践中取得了的一些成就。其中单抗治疗在靶向治疗中又显示出良好的抗肿瘤效果,抗体可特异靶向识别并结合肿瘤细胞表面抗原、补体、血管内皮细胞生长因子或表皮生长因子,通过补体或抗体依赖的细胞毒性作用,或诱导细胞凋亡,或抑制肿瘤血管形成。抗体IgG分子由两条相同的重链和轻链组成,重链由VH和CH1、CH2和CH3组成,轻链由VL和CL组成。与Fab等小分子抗体相比,IgG亲合力较高,稳定性较好,并且可以激活补体系统以及Fc受体介导的生物效应功能。目前国内多采用原核细胞表达小分子抗体ScFv及Fab,而全分子抗体研究较少,目前常用的原核表达系统大肠杆菌无法表达具有完整功能的抗体分子,要把来源于噬菌体抗体库的人源Fab转换成全分子抗体,必须换用真核细胞表达系统。本研究在实验室已制备的抗Trop-2Fab的基础上,构建全人源抗Trop-2抗体的真核表达载体,并在CHOdhfr-细胞中表达,为生产具有完整功能的全分子抗体及其临床应用研究奠定了基础。目的1.以抗Trop-2抗体Fab基因为模板,构建人源抗Trop-2抗体的IgG真核表达系统。2.表达并纯化IgG抗体,对抗体的活性进行分析,并观察抗Trop-2单克隆抗体对胰腺癌细胞增殖的抑制作用。方法1.抗Trop-2抗体IgG重组表达载体的构建：采用PCR分别扩增抗Trop-2抗体的重链和轻链基因,分别双酶切pWS-2载体和轻链,将轻链基因克隆于载体pWS-2中,测序正确后提取质粒,命名为pWS-L,再分别双酶切pWS-L载体和重链,将重链基因克隆于载体pWS-L中,测序正确后提取质粒。2.抗Trop-2抗体IgG的表达及纯化：重组质粒转染CHO dhfr-细胞,加药筛选后进行亚克隆。阳性单克隆扩大培养后收集上清,采用ProteinG亲和柱纯化,获得抗Trop-2的IgG抗体分子。3.抗Trop-2抗体的鉴定：通过酶联免疫法、Western blot、免疫荧光、流式细胞术分析抗Trop-2抗体的免疫学特性。4.用MTT法分析抗Trop-2抗体对胰腺癌细胞BxPC-3的生长抑制作用。结果1.经PCR扩增、基因克隆和核酸序列分析,本研究成功构建了抗Trop-2抗体IgG真核表达系统；转染CHO dhfr-细胞后,加药筛选出能够稳定表达抗Trop-2的IgG抗体分子的单克隆抗体细胞株；并获得纯度较高的抗Trop-2人源化IgG抗体分子。2. SDS-PAGE和Western blot均显示两条带,分别为28kD和55kD,与蛋白预期大小一致,免疫荧光检测显示抗Trop-2抗体可以识别胰腺癌细胞表面的Trop-2膜蛋白；FACS检测结果显示,抗Trop-2抗体能够与胰腺癌细胞结合。3.MTT检测结果表明,随着时间延长和抗体剂量的增加,抗Trop-2抗体对细胞的生长抑制作用也愈明显,即呈时效、量效依赖关系。其中以浓度最高的抗体作用72小时对细胞抑制率最高(84.15%)；与对照组相比,不同浓度的抗体对细胞增殖的抑制率均有明显的差异(P<0.05)。结论1.本研究成功构建了抗Trop-2抗体的IgG真核表达系统,成功筛选并纯化出抗Trop-2人源IgG抗体分子,该抗体可特异性识别胰腺癌细胞表面的Trop-2蛋白。2.抗Trop-2人源化IgG抗体对胰腺癌细胞的增殖有一定的抑制作用。