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目的:
在体外试验系统,探讨三价锑化合物~酒石酸锑钾(potassiumantimonyl tartrate,PAT)对L-02肝细胞的毒性影响及其作用机制。
方法:以L-02肝细胞为受试细胞,通过MTT试验检测不同浓度的酒石酸锑钾对L-02肝细胞存活率的影响,选择细胞存活率为40%-90%的浓度进行后续实验。设置5个PAT处理组即100gmol/L、200umol/L、400umol/L、800umol/L、1600umol/L和1个对照组,PAT处理细胞时间为24h。L-02肝细胞的形态学改变和细胞周期的变化分别用HE染色法和流式细胞仪检测分析;PAT对L-02肝细胞膜通透性影响和细胞毒性作用采用乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性水平来评价;PAT诱导L-02肝细胞氧化损伤程度选用超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合成酶(NOS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和一氧化氮(NO)含量等指标评价;用线粒体跨膜电位(△ψm)检测细胞线粒体损伤;用荧光比色法测定细胞内游离钙离子浓度;用单细胞凝胶电泳(SCGE)检测肝细胞DNA损伤。
结果:
1.PAT引起L-02肝细胞存活率降低:在100-1600umol/LPAT处理浓度,能明显引起L-02肝细胞存活率的降低,且存在着浓度.反应关系,相关系数r=-0.950。
2.PAT引起L-02肝细胞形态学改变:PAT处理24h,引起L-02肝细胞皱缩或肿大,染色质浓染,细胞间隙扩大,随着PAT浓度的增加变化明显,细胞密度也明显减少,细胞膜和核膜不完整或消失,染色质嗜碱性降低。
3.PAT对L-02细胞周期的影响:PAT引起L-02细胞周期发生变化:在100umol/L、200umol/LPAI组,引起S期细胞增加,其中以200umol/LPAT明显高于对照组(P<0.05);但各PAT处理组,均引起G<,2>期细胞减少,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。
4.PAT引起细胞膜通透性增加且有细胞毒性作用:PAT引起细胞培养上清液中LDH、AST、ALT活性增加(p<0.05)。
5.PAT所致DNA损伤:PNT能明显诱导细胞DNA的链断裂,剂量越高,DNA断裂程度越严重(p<0.05)。
6.PAT导致L-02细胞氧化损伤:PAT导致细胞内的MDA和NO的含量增加,NOS、SOD活性增强,GSH含量减少(p<0.05)。
7.PAT对线粒体膜电位的影响:用PAT处理的L-02细胞,荧光吸光光度值升高,线粒体膜电位明显降低(p<0.05),且有剂量一反应关系(r=0.962)。
8.PAT对钙稳态的影响:在低剂量处理组,细胞内钙离子浓度降低,400μmol/L及以上剂量,导致细胞内游离钙离子浓度显著增加(p<0.05)。
结论:
PAT在一定浓度下,能引起L-02肝细胞存活率下降,细胞膜通透性增加和细胞周期改变,并诱发DNA损伤,对肝细胞具有明显的损伤作用;其损伤的作用机制可能与PAT导致肝细胞氧化损伤、线粒体崩溃和钙稳态失调等途径有关。