动物源性食品的兽药残留问题层出不穷,不仅对环境造成危害,还给消费者健康带来极大的安全隐患。而手性兽药的开发和利用,使监控和检测兽药残留的工作变得更为艰难。抗体作为一种良好的手性选择剂,不仅可用于建立免疫分析方法,实现高通量检测食品中残留的违禁药品,还能灵敏识别手性药物对映体的微小差异,可用于研究手性小分子药物的识别过程。然而由于缺乏了解抗体识别手性药物的分子机制,目前关于抗体识别手性药物对映体的实际应用仍十分局限。氧氟沙星是第二代氟喹诺酮类抗生素,广泛用于临床医学和兽医学。本文以氧氟沙星对映体为模型,利用X-射线蛋白质结晶技术,研究抗体Fab片段与氧氟沙星对映体的选择性识别机制,主要进行了以下方面的工作:(1)左旋氧氟沙星和右旋氧氟沙星抗体Fab片段制备通过木瓜蛋白酶水解单克隆抗体获得含有目的Fab片段的混合产物,运用Protien L亲和层析和凝胶过滤层析的纯化方法,获得较高纯度的Fab片段,得率约30%。(2)氧氟沙星抗体Fab片段的鉴定通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定所制备的左旋和右旋氧氟沙星抗体Fab片段的纯度,并利用肽指纹图谱和MALDI-TOF质谱手段,获取左旋氧氟沙星抗体Fab片段的氨基酸序列和确定其分子量大小在50 kD左右。(3)左旋氧氟沙星和右旋氧氟沙星抗体Fab片段的ELISA检测方法根据间接竞争性ELISA工作原理,建立左旋氧氟沙星抗体Fab片段的标准曲线,左旋氧氟沙星药物的半抑制浓度为0.13 ng/mL,检测限为0.007 ng/mL,线性范围0.02-0.8 ng/mL;建立右旋氧氟沙星抗体Fab片段的标准曲线,右旋氧氟沙星药物的半抑制浓度为8.55 ng/mL,检测限为0.35 ng/mL,线性范围1.15-63.82 ng/mL;与亲本单克隆抗体相比,左旋和右旋氧氟沙星抗体Fab片段仍具有良好的对映选择性。(4)左旋氧氟沙星和右旋氧氟沙星抗体Fab片段与对映体的相互作用使用Biacore T200分子间相互作用分析仪研究抗体Fab片段与手性小分子之间的结合动力学过程,左旋和右旋氧氟沙星抗体Fab片段在结合对映体时具有不同的结合和解离速率常数;左旋氧氟沙星抗体Fab与左旋氧氟沙星的亲和力常数K_D为0.79μM,与右旋氧氟沙星的K_D为99.7μM;右旋氧氟沙星抗体Fab与左旋氧氟沙星的K_D为0.41μM,与右旋氧氟沙星的K_D为22.81 nM。(5)X-射线蛋白质结晶实验运用气相扩散法,制备左旋氧氟沙星和右旋氧氟沙星抗体Fab片段及其与小分子复合物的蛋白质晶体,X-射线衍射分辨率均达到2.8?以下,并初步解析左旋氧氟沙星抗体Fab片段及其复合物的三维结构信息,结果表明轻链CDR2区Y53对抗原识别和手性选择性具有关键作用,为免疫分析应用提供理论基础。