牙骨质是贴附在牙根表面的薄层矿化组织,是牙周组织的重要组成部分,也是正畸治疗牙齿移动的基础。在牙根发育完成后牙骨质通常不再发生生理性改建,缺乏与骨组织类似的重塑能力。在正畸治疗导致牙骨质吸收后,牙骨质的修复依靠成牙骨质细胞完成,伴随成牙骨质细胞增殖、分化及矿化,逐渐形成修复性牙骨质。因此研究如何提高成牙骨质细胞的功能对于牙骨质修复十分重要,也为防治正畸性牙根吸收和牙周组织修复提供理论基础。IL1β是感染早期最常见的细胞因子之一,可调节免疫反应介导的炎症作用,在正畸患者和牙周炎患者的牙周组织中高表达,有诱导炎症损伤、促进骨吸收和抑制成骨细胞分化的作用。但是,IL1β在牙骨质代谢中的作用,尤其是对成牙骨质细胞的作用机制研究较少,我们进行以下实验旨在探讨IL1β对成牙骨质细胞分化的作用及机制,为炎症性牙骨质丧失疾病的防治提供理论基础。1.IL1β对成牙骨质细胞的作用目的:探讨IL1β对成牙骨质细胞增殖、分化及矿化作用。方法:培养成牙骨质细胞系OCCM-30,使用IL1β重组蛋白(10 ng/mL)处理成牙骨质细胞并对其进行成牙骨质矿化诱导。MTT法检测IL1β对成牙骨质细胞增殖的影响;流式细胞术观察IL1β对成牙骨质细胞凋亡的影响;real-time PCR及Western blot法测定成牙骨质分化相关基因runx2和osterix的表达水平;微板法定量和染色法定性检测成牙骨质细胞的碱性磷酸酶活性;茜素红染色及相对定量分析矿化结节形成量。结果:IL1β对成牙骨质细胞的增殖及凋亡无影响;下调runx2和osterix的表达水平,降低碱性磷酸酶活性及矿化结节形成能力。结论:IL1β对成牙骨质细胞的分化有抑制作用。2.MiR-325-3p在IL1β抑制的成牙骨质细胞分化中的调控作用目的:在microRNA参与的转录后基因表达调控水平上,探讨IL1β抑制成牙骨质细胞分化的作用机制。方法:利用生物信息学分析技术及real-time PCR实验筛选出miR-325-3p,应用双荧光素酶及免疫荧光实验验证其靶基因。在加入IL1β刺激的同时瞬时转染miR-325-3p,检测成牙骨质细胞分化相关基因runx2和osterix的表达水平。同时,建立小鼠异位成骨模型,对移植物进行micro-CT、碱性磷酸酶活性及钙离子含量检测。结果:IL1β上调miR-325-3p的表达,且miR-325-3p直接靶向runx2。转染miR-325-3p mimic可下调成牙骨质细胞runx2和osterix的表达水平,在异位成骨实验中可显著降低新形成的牙骨质样组织的骨密度、骨体积分数、碱性磷酸酶活性及钙离子含量;而转染miR-325-3p inhibitor得到的结果与mimic完全相反。在加入IL1β刺激的炎症状态下,成牙骨质分化相关基因表达及体内成牙骨质能力显著降低;并且在转染miR-325-3p inhibitor后IL1β的作用被减弱。结论:IL1β通过上调miR-325-3p的表达,直接作用于靶基因runx2,进而抑制成牙骨质细胞分化;转染miR-325-3p inhibitor可减弱IL1β对成牙骨质细胞分化的抑制作用。3.转录组测序分析IL1β对牙骨质细胞分化的作用机制目的:在转录水平上更全面地探讨IL1β抑制成牙骨质细胞分化的作用机制。方法:对IL1β处理与非处理组的成牙骨质细胞生物样本进行转录组二代测序分析。首先,收集细胞样本,提取样本RNA,构建RNA-seq文库;其次,对文库测序并对测序数据进行质量检测、数据过滤及统计;然后,对测序数据进行差异表达分析、GO和KEGG生物信息学分析。结果:成牙骨质细胞生物样本文库构建成功;测序样本达到高质量读段控制标准;共得到112个显著差异基因,包括85个上调基因和27个下调基因;GO富集分析揭示了整个作用过程中有1735个GO功能条目被显著富集(p<0.05),在免疫应答反应、对细胞外刺激反应等条目中显示富集较高;KEGG富集分析显示共有12个通路被显著富集(p<0.05),其中TNF信号通路、细胞因子与受体相互作用途径、趋化因子信号通路、PI3K-Akt信号通路、Toll样受体信号通路、JakSTAT信号通路为最主要的富集通路。结论:IL1β可刺激成牙骨质细胞产生免疫应答等多种生物学反应,可能通过TNF、PI3K-Akt等信号通路途径发挥作用,为探讨IL1β抑制成牙骨质细胞分化的作用机制提供有价值的新线索。4.Lcn2对成牙骨质细胞分化的作用目的:Lcn2作为测序得到的差异最显著且表达丰度较高的“关键”基因,其在成牙骨质代谢调控中的作用亟待研究,本部分实验旨在探讨lcn2在调节成牙骨质细胞分化中的作用。方法:构建lcn2过表达质粒载体和沉默lcn2的siRNA,使用瞬时转染法建立成牙骨质细胞过表达和敲减体系;流式细胞技术检测转染效率;real-time PCR和Western blot法检测lcn2过表达和敲减的效果,以及对分化相关基因runx2、osterix等基因和蛋白表达情况的影响。结果:成功构建lcn2过表达质粒及沉默siRNA,瞬时转染效率较高。在mRNA水平上过表达lcn2显著高于对照组约25倍,敲减后约为对照组的一半;在蛋白水平上过表达lcn2表达增加约一倍,敲减后约为对照组的一半。Lcn2对成牙骨质细胞分化相关基因runx2、osterix、alp和ocn mRNA表达起负调控作用,对opn mRNA表达起正调控作用,对runx2和osterix的蛋白表达具有负调控作用。结论:Lcn2对成牙骨质细胞的分化有抑制作用。综上所述,IL1β对成牙骨质细胞分化有抑制作用,其机制可能是在microRNA参与的转录后基因表达调控层面,通过激活miR-325-3p进而抑制下游转录因子runx2的表达,完成抑制成牙骨质细胞分化的过程;也可能是在转录水平的调控,测序筛选出的关键蛋白lcn2的表达被激活,进而抑制成牙骨质细胞的分化;转录组测序结果为以后的研究提供线索,有待于进一步挖掘。