论文部分内容阅读
维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid inducible-geneⅠ，RIG-Ⅰ)是机体天然免疫系统中一类重要的模式识别受体，能够识别病毒RNA，诱导Ⅰ型干扰素、细胞因子及趋化因子的产生，对机体抗病毒天然免疫的建立有重要作用。本实验旨在建立表达RIG-Ⅰ的转基因鸡模型，通过细胞水平的研究来揭示在表达RIG-Ⅰ的F1代CEF细胞中是否重新建立了RIG-Ⅰ信号通路，并具有抑制流感病毒活性的作用。 本研究采用赤道开窗法，将符合注射标准滴度的重组慢病毒通过显微注射针注射到受精蛋胚盘下腔，成功培育了转入RIG-Ⅰ基因的F0代转基因鸡;运用PCR、Southern blot、RT-PCR、Western blot分别在DNA、RNA、蛋白质水平对F0代鸡进行鉴定分析;结果表明，15只F0代转基因鸡中6只有RIG-Ⅰ基因的整合和表达;选取F0代表达RIG-Ⅰ的转基因公鸡与同品种野生型母鸡进行杂交繁育F1代，利用上述相同的方法对F1代转基因鸡进行鉴定分析;结果表明繁育的部分F1代转基因鸡中7只有外源基因的整合和表达，证明表达RIG-Ⅰ的F0代转基因鸡携带的外源基因能够遗传至F1代。 分离与培养-F1代的CEF细胞，经分子生物学方法鉴定后，将其分为转基因组(TG)、非转基因组(NTG)和野生型组(WT)。用禽流感病毒感染CEF细胞,通过Western blot测定RIG-Ⅰ蛋白的表达量，间接免疫荧光(IFA)和TCID50测定流感病毒的复制情况，荧光定量PCR(qRT-PCR)检测RIG-Ⅰ及其下游IFN-β，抗病毒分子(PKR，OASL，MX1)，促炎症细胞因子（IRF7，IFIT5）以及流感模型基因(PB2)的mRNA水平。qRT-PCR和Western blot结果表明，TG组CEF细胞中感染组RIG-Ⅰ的mRNA水平和RIG-Ⅰ蛋白的表达量均高于未感染组;TG组与WT组相比，口N-β上调2.4倍，其他细胞因子IRF7，IFIT5，PKR，OASL，MX1分别上调了2.1倍，1.5倍，1.9倍，2倍，1.9倍;IFA、TCID50与PB2基因拷贝数的结果表明TG组CEF细胞中流感病毒的增殖量均低于WT组。 本研究获得的F0代RIG-Ⅰ转基因鸡体内有外源基因的整合与表达，其携带的外源基因能够稳定遗传至F1代;证明了在表达RIG-Ⅰ的F1代CEF细胞中重新建立了RIG-Ⅰ信号通路，并具有抑制流感病毒的作用。为探索RIG-Ⅰ基因在鸡体内参与家禽天然免疫的机制及抑制流感病毒复制的作用奠定了基础，并可为药物开发等应用研究提供新的思路。