Dicer-1和Argonaute-1在豌豆蚜免疫防御反应中的作用研究

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豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)严重危害豆科植物和牧草,是农林业生产中的重要防治对象。利用天敌和病原微生物的生物防治技术已成为新的研究热点,深入了解豌豆蚜抵御病原物侵染的免疫防御机制是对其进行生物防治的前提。豌豆蚜缺失大量免疫相关的基因,但其体内micro RNA(mi RNA)的合成和作用通路是完整的,Dicer-1是mi RNA合成过程中行使切割作用的内切酶,对mi RNA的合成至关重要;Argonaute-1(Ago-1)是mi RNA通路中RNA诱导沉默复合物(RNA-inducing silencing complex,RISC)的重要组成部分,与mi RNA功能的发挥密切相关。有研究表明Dicer-1和Ago-1在昆虫抵御细菌侵染的过程中起作用。为了探究Dicer-1和Ago-1是否与豌豆蚜抵御病原物侵染的免疫防御反应有关,本研究分别选取革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)和真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)对豌豆蚜进行感染。首先,我们检测了细菌和真菌感染后豌豆蚜Dicer-1和Ago-1基因表达的变化,并利用RNA干扰技术(RNAi)沉默了豌豆蚜的Dicer-1和Ago-1基因,在干扰目的基因后对豌豆蚜进行细菌和真菌感染,检测了豌豆蚜体内细菌和真菌的增殖情况,并对感染后豌豆蚜的存活率进行了统计。主要结果如下:1.蛋白结构域分析发现:豌豆蚜Dicer-1酶具有1个RNA解旋酶结构域、1个PAZ结构域、2个RnaseШ结构域和1个双链RNA结合结构域;Ago-1蛋白具有1个DUF 1785结构域、1个PAZ结构域和1个Piwi结构域,这些结构域在进化上高度保守。2.在感染细菌S.aureus、E.coli和真菌B.bassiana后,豌豆蚜Dicer-1和Ago-1的表达水平在部分时间点上调,且与对照组差异显著,表明豌豆蚜Dicer-1和Ago-1响应病原细菌和真菌的感染。3.注射dsRNA后,豌豆蚜Dicer-1和Ago-1成功被干扰,干扰效果显著,且具有一定持续性。4.干扰Dicer-1和Ago-1后分别感染细菌S.aureus、E.coli和真菌B.bassiana,豌豆蚜体内的细菌菌落数和真菌孢子数均显著高于对照组。5.干扰Dicer-1后感染细菌S.aureus和E.coli,豌豆蚜的存活率降低,且在干扰后感染E.coli,其存活率与对照组存在显著差异;干扰后感染真菌B.bassiana,其存活率显著低于对照组。干扰Ago-1后,豌豆蚜存活率降低;在干扰后感染细菌S.aureus和E.coli,豌豆蚜存活率低于对照组,且在干扰后感染S.aureus,其存活率与对照组存在显著差异;干扰Ago-1后感染真菌B.bassiana,豌豆蚜存活率显著低于对照组。结论:Dicer-1和Ago-1参与了豌豆蚜的抗菌反应,二者在豌豆蚜抗B.bassiana反应中均发挥重要作用,且不同程度的参与豌豆蚜抵御S.aureus和E.coli入侵的免疫反应。暗示依赖Dicer-1和Ago-1的mi RNAs在豌豆蚜抵御细菌和真菌侵染的免疫反应中可能发挥潜在的调控作用。
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