目的:参附汤是治疗缺血性心脏病的临床常用经典名方,主要用治心肾阳虚、阳虚气弱证缺血性心脏病,其疗效已得到广泛的临床证实。但因参附汤有效成分复杂多样,其对缺血性心肌的保护作用机制研究尚不深入。前期实验中已知参附汤有效成分中的人参皂苷Rg1、Re、乌头原碱Aconine单体及配伍对心肌细胞钙离子的有效调控作用,本实验研究从抗氧化应激角度探讨三种单体及配伍对缺氧复氧损伤H9C2心肌细胞的保护作用及分子机制。主要检测指标包括抗氧化蛋白酶类Prx-3、SOD2,活性氧（ROS）,促细胞凋亡因子Bax以及抗氧化相关上游信号通路因子Nrf-2。通过观察各种氧化应激相关蛋白活性变化,探讨参附汤三种有效成分及配伍对抗氧化相关蛋白标志物的调控作用及机制,以期从微观角度丰富参附汤对缺血性心肌病的保护作用机制,为参附汤益气温阳治疗缺血性心脏病的中医药理论提供现代科学证据。研究结果显示,Rg1/Re配伍组能够上调Prx-3/SOD2表达并降低ROS生成水平;Rg1/Aconine配伍组能够激活Nrf-2信号通路并下调ROS水平;Aconine组可以上调Prx-3表达并降低ROS水平。实验结果证实参附汤三种有效成分配伍后能够发挥一定程度的抗氧化应激作用,进而保护缺血心肌。方法:1.缺氧复氧损伤心肌细胞模型的制备:细胞选用H9C2心肌细胞系,缺氧培养阶段:用无糖无血清培养液,95%N₂+5%CO₂混合气体模拟缺氧环境给缺氧小室换气10分钟,在这种模拟缺氧条件下培养细胞,然后将缺氧完成的细胞再转移至新鲜完全培养液和5%CO₂、37℃正常培养箱内培养,进行复氧。最后CCK-8法细胞生存率检测（生存率保持在50%-60%）。2.分组:（1）正常组（无药、无DMSO、无缺氧复氧）（2）DMSO组（无药、含DMSO 2μl/ml、无缺氧复氧）（3）DMSO+HR组（无药、含DMSO 2μl/ml、缺氧复氧）（4）Rg1+HR组（Rg1 200μM、缺氧复氧）（5）Re+HR组（Re 200μΜ、缺氧复氧）（6）Aconine+HR组（Aconine 100μΜ、缺氧复氧）（7）Rg1+Re+HR组（Rg1 200μM+Re 200μΜ、缺氧复氧）（8）Rg1+Aconine+HR组（Rg1 200μM+Aconine 100μΜ、缺氧复氧）（9）Re+Aconine+HR组（Re 200μM+Aconine 100μΜ、缺氧复氧）（10）Rg1+Re+Aconine+HR组（Rg1 200μM+Re 25μΜ+Aconine 100μΜ、缺氧复氧）注:因药物以DMSO稀释,虽然微量的DMSO对细胞无明显毒性,我们仍在空白组和对照组都添加了DMSO,以减少实验误差。3.Western blot蛋白免疫印迹法:将细胞裂解,取上清并添加1/4量loading buffer,95℃水浴变性10分钟,然后置于冰上骤冷,样本制备完成。根据目的蛋白分子大小配制所需浓度分离胶,配制浓缩胶,上样、电泳、转膜。5%脱脂牛奶室温摇床封闭1小时,然后内参膜放入β-actin一抗,目的蛋白膜放入相应一抗,4℃冰箱孵育过夜。弃一抗,TBST清洗10分钟3次,然后放入二抗,室温摇床孵育1小时。弃二抗,TBST清洗10分钟3次。显影液A液B液1:1配制,避光敷至膜上,然后化学发光凝胶成像仪内拍照。4.细胞免疫荧光:细胞培养完成后,弃除培养液,PBS清洗一下,甲醇固定10分钟。弃除甲醇,PBS清洗5分钟3次,加入Triton100孵育15分钟,弃除Triton100,加入5%BSA封闭1小时。加一抗,4℃冰箱过夜。PBS清洗10分钟3次,避光操作,加入荧光二抗孵育1小时。PBS清洗15分钟3次。载玻片上滴加DAPI或甘油,细胞爬片面朝下敷与之上。湿盒内暂存,荧光显微镜拍照。结果:1.通过CCK-8法细胞生存率检测所得出的结果（生存率保持在50-60%）,选定造模条件:无糖无血清培养液,95%N₂+5%CO₂混合气体模拟缺氧环境给缺氧小室换气10分钟,模拟缺氧条件下培养细胞24小时后,将缺氧完成的细胞再转移至新鲜完全培养液和5%CO₂、37℃正常培养箱内培养,复氧3小时。2.Western blotting检测Prx-3结果:DMSO+HR模型组细胞Prx-3水平明显下降（P<0.05,N=6）,Aconine+HR、Rg1+Re+HR、Rg1+Aconine+HR组则明显提高了缺氧复氧损伤心肌细胞的Prx-3水平（P<0.01,N=6）。3.细胞免疫荧光法检测各指标结果:1)Prx-3:DMSO+HR组（模型组）Prx-3含量明显低于DMSO（空白组）组（P<0.05,N=4）;Re+HR组、Rg1+Re+HR组、Aconine+HR组、Rg1+Re+Aconine+HR组均有效提高了Prx-3水平,各组P值都小于0.05,差异具有统计学意义。尤其Rg1+Re+HR组显著提高了该组细胞Prx-3蛋白含量（P=0.0002<0.001）2)SOD2:DMSO+HR组与DMSO空白组之间有明显差异（P<0.05,N=4）,SOD2含量降低。药物处理各组只有Rg1+Re+HR组能够提高缺氧复氧损伤心肌细胞的SOD2含量（P<0.01,N=4）。3)ROS:DMSO+HR组与DMSO空白组之间有明显差异（P<0.05,N=4）,ROS水平升高。用药各组均不同程度降低了缺氧复氧损伤心肌细胞的ROS水平,除外Re+Aconine+HR组无统计学意义（P>0.05）,其他各用药组均下调了本组细胞的ROS水平,且各组P值均小于0.01,与DMSO+HR组比较具有明显统计学差异。4)Bax:DMSO+HR组与DMSO空白组之间有明显差异（P<0.05,N=4）,Bax水平升高。用药各组均未表现出对受损H9C2心肌细胞内Bax蛋白的下调作用。5)Nrf-2:DMSO+HR组与DMSO空白组之间有明显差异（P<0.05,N=4）,Nrf-2信号减弱。药物处理各组只有Rg1+Aconine+HR组的Nrf-2活性增强且具有统计意义（P<0.05,N=4）。结论:1.细胞造模条件,即95%N₂+5%CO₂混合气体换气10分钟模拟缺氧环境,然后将细胞缺氧培养24小时,缺氧结束后再复氧培养3小时。2.Rg1·200μM+Re·200μM+HR组具有相对稳定的抗氧化应激作用,作用机制可能是降低缺氧复氧损伤心肌细胞ROS生成水平的同时提高了Prx-3、SOD2水平。3.Aconine·100μM+HR组表现出了上调缺氧复氧损伤心肌细胞Prx-3的作用,并下调了细胞ROS水平,可以认为其具有抗氧化应激作用。4.Rg1·200μM+Aconine·100μM+HR组减少缺氧复氧损伤心肌细胞内ROS生成水平的作用可能与其能够激活Nrf-2信号通路有关。5.实验中,我们选用的各组参附汤有效成分Rg1、Re、Aconine及配伍的不同剂量浓度,对促凋亡因子Bax并无有效的调控作用。