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外泌体作为一种载体,具有很多重要的生理功能。动物乳中富含丰富的外泌体,而不同来源乳中外泌体的形态结构及蛋白质的种类和功能存在一定的差异。本研究针对不同动物乳源性外泌体的分离鉴定及其差异性蛋白潜在功能进行研究,具体内容如下:试验一:本试验旨在分离鉴定荷斯坦奶牛、牦牛和骆驼乳源性外泌体。通过差速超速离心法对荷斯坦奶牛、牦牛和骆驼乳源性外泌体进行提取;采用透射电镜(TEM)、蛋白定量、蛋白印迹(WB)和粒径分析(NTA)对三种动物乳源性外泌体进行鉴定;通过细胞毒性试验检测三种动物乳源性外泌体对细胞的毒性。研究结果表明:(1)荷斯坦奶牛、牦牛和骆驼乳源性的外泌体与其他生物学样本的外泌体形态结构相似,都是具有茶托样的双层膜结构;(2)蛋白定量荷斯坦奶牛和牦牛乳中外泌体蛋白浓度无显著性差异(P=0.82),而荷斯坦奶牛与骆驼乳中外泌体蛋白浓度均在显著性差异(P<0.05),牦牛乳与骆驼乳中外泌体蛋白浓度存在显著性差异(P<0.05);(3)在三种动物乳外泌体中分别鉴定到了ALIX、CD63、CD81、TSG101和HSP70等标志性蛋白;(4)三种动物乳源性外泌体的峰值都比较单一,均在150 nm以内,且骆驼的较荷斯坦奶牛和骆驼大;(5)差速超速离心法提取的三种动物乳源性外泌体均没有细胞毒性,因此提取得到的三种动物乳源性外泌体均可用于细胞水平的试验。试验二:本试验旨在对不同动物乳源性外泌体的蛋白质进行鉴定。利用非标记蛋白质组学定量、生物信息学分析等方法对荷斯坦奶牛、牦牛和骆驼乳源性外泌体的差异性蛋白进行鉴定。(1)总共鉴定到1746种蛋白质(荷斯坦奶牛759、牦牛980、骆驼1284)。(2)进一步通过GO对荷斯坦奶牛、牦牛和骆驼乳源性外泌体亚细胞定位、分子功能和生物学途径进行分析,GO分析得出,乳源性外泌体主要参与ATP合成和Toll样受体信号通路等生物学途径。(3)定量结果表明,荷斯坦奶牛、牦牛和骆驼乳中外泌体有373个差异性蛋白,其中22个外泌体蛋白在荷斯坦奶牛乳中上调表达,115个外泌体蛋白在牦牛乳中上调表达,236个在骆驼乳中上调表达,这些差异蛋白主要参与血管生成、病毒、细菌感染和癌症等信号通路,而骆驼乳源性外泌体上调表达的蛋白主要与炎症反应和抗癌有关。此研究结果为乳源性外泌体的深入研究提供了参考依据。试验三:本试验旨在比较两种提取娟姗牛乳源性外泌体的方法。通过差速超速离心法和试剂盒法对娟姗牛乳外泌体进行提取,并通过TEM、蛋白定量、WB和NTA对提取的外泌体进行鉴定,同时通过细胞毒性试验检测试剂盒提取的娟姗牛乳源性外泌体的细胞毒性。研究结果表明:(1)电镜视野下,两种方法提取的外泌体都观察到了典型的茶托样结构,但试剂盒法比差速超速离心法提取的外泌体数量更多;(2)试剂盒法提取的外泌体蛋白浓度显著高于差速超速离心法(P<0.05);(3)试剂盒法提取的外泌体标志性蛋白较差速超速离心法丰度高;(4)两种方法提取的外泌体峰值单一,都在150 nm以内;(5)试剂盒法提取的外泌体对细胞没有毒性。因此试剂盒更适用于娟姗牛乳源性外泌体的提取。