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目的本实验旨在通过研究脊髓线粒体自噬障碍与吗啡耐受的相关性,探讨其导致吗啡耐受的分子机制,为治疗吗啡耐受提供可能的途径和方法,为后续的研究和药物开发提供借鉴和依据。方法(1)建立慢性吗啡耐受的整体动物模型,通过透射电子显微镜,免疫印迹(western blotting),丙二醛含量检测,DCFH-DA荧光探针检测等方法,检测吗啡耐受过程中脊髓线粒体的损伤及其形态和功能的改变。(2)利用免疫印迹,在小鼠单次吗啡鞘内注射后不同时程(短时程)和吗啡耐受模型过程中的不同时程(长时程)检测自噬相关蛋白的表达水平;利用免疫荧光技术,检测吗啡对小鼠脊髓中微管相关蛋白-Ⅱ(microtubule-associated protein,LC3)和p62蛋白的影响及细胞特异性,包括神经元,星型胶质细胞和小胶质细胞。(3)通过流式细胞术,观察吗啡刺激对SH-SY5Y细胞线粒体功能的影响;利用免疫印迹在SH-SY5Y细胞中检测吗啡导致的线粒体自噬障碍是否具有阿片受体依赖性。(4)利用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染实验,荧光探针瞬时转染实验,免疫印迹,考察吗啡刺激后细胞内LC3和p62的降解情况,判断自噬流是否通畅,考察吗啡影响线粒体自噬的具体发生阶段。(5)利用荧光探针瞬时转染实验和免疫印迹实验,检测受损线粒体的泛素化情况以及Parkin,PTEN基因诱导激酶1(PTEN induced putative kinase,PINK 1)蛋白的变化。结果(1)慢性吗啡处理后丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族蛋白脊髓背角上的表达水平显著增加;脊髓超氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)水平和Bcl-2相关X蛋白/B淋巴细胞瘤-2基因比值(Bcl-2 Associated X Protein,BAX;B-cell lymphoma-2,Bcl-2)明显升高,腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase,AMPK)磷酸化水平增加;电镜下观察到神经元线粒体数量变少,形状变为不规则。(2)脊髓中自噬相关基因5(autophagy associated gene,Atg)、LC3和p62的表达量均在小鼠吗啡耐受过程中有明显上升,Beclin 1表达量没有显著改变;在小鼠脊髓背角,吗啡耐受后LC3和p62明显增加,并在神经元、小胶质细胞和星型胶质细胞中均有出现,其中在神经元中分布最多。(3)吗啡刺激SH-SY5Y细胞导致ROS产生量显著增加,线粒体膜电位降低;吗啡导致的LC3和p62表达增加具有阿片受体依赖性。(4)雷帕霉素和饥饿处理时,转染mRFP-GFP-LC3腺病毒的对照组细胞出现显著地自噬,而使用吗啡处理后,LC3没有成功被溶酶体降解,自噬流受阻,并且不是通过抑制溶酶体功能实现的;Western blotting结果也表明,吗啡对自噬流的抑制作用与氯喹相似都是抑制了 p62的降解;当单独使用线粒体损伤因素处理细胞时,很快诱发了线粒体自噬,形成的自噬小体对线粒体进行了识别、包裹,而使用吗啡处理后再使用线粒体损伤剂处理细胞,受损的线粒体就不能被自噬体识别、包裹。同时,吗啡抑制了受损线粒体向溶酶体的运输。(5)吗啡抑制了 Parkin向损伤线粒体的募集,导致线粒体泛素化水平降低;吗啡抑制了线粒体泛素化是通过降低胞内PINK1的累积,抑制Parkin s65位点的磷酸化而实现的。结论1、吗啡可导致脊髓背角中神经元细胞内线粒体发生损伤,导致ROS产生增多;同时吗啡导致线粒体自噬发生了障碍。2、吗啡通过降低胞内PINK1蛋白的累积,同时抑制了 Parkin s65位点的磷酸化,导致Parkin蛋白向线粒体的募集被抑制,导致损伤线粒体泛素化水平降低,因此自噬体无法对损伤线粒体进行识别,从而无法清除受损线粒体。