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目的:通过喂食高脂饲料的方法建立高脂血症wistar大鼠模型,观察解郁祛痰化浊方对高脂血症大鼠血脂、肝肾功能、肝肠病理切片的HE染色的影响,并采用生物信息学的分析方法探索肠道微生物变化与高脂血症之间的关系,研究解郁祛痰化浊方对高脂血症大鼠肠道菌群分布特征,探讨中药通过对肠道微生物群的影响进而干预高脂血症大鼠血脂水平的可能机制。
方法:采用高脂饲料喂养的方法建立高脂血症大鼠模型,通过随机数字表的方法将体质量为200+20g的70只清洁雄性Wistar大鼠进行1周的适应性喂养后,称重,禁食12-16h后眼底静脉丛取血,检测生化指标,所有标本均符合要求,然后将70只大鼠随机抽取10只作为正常组,余60只大鼠作为模型组,正常组喂食正常饲料,0模型组喂食高脂饲料,喂养12周后建立高脂血症大鼠动物模型。然后把模型组大鼠随机分为以下6组,每组10只,即模型组,血脂康组,立普妥组,解郁祛痰化浊方低剂量组,解郁祛痰化浊方中剂量组,解郁祛痰化浊方高剂量组。正常组继续喂食正常饲料,模型组、血脂康组、立普妥组、解郁祛痰化浊方低剂量组、解郁祛痰化浊方中剂量组、解郁祛痰化浊方高剂量组给予高脂饲料喂养,同时正常组和模型组给予等量无菌蒸馏水灌胃,血脂康组给予血脂康0.1g/kg,立普妥组给予立普妥2mg/kg,解郁祛痰化浊方低剂量组给予0.4g/kg解郁祛痰化浊方,解郁祛痰化浊方中剂量组给予0.8g/kg解郁祛痰化浊方,解郁祛痰化浊方高剂量组给予1.6g/kg解郁祛痰化浊方灌胃,连续灌胃8周,在灌胃结束当天,由于取样的原因,先分别收集7组大鼠质地、大小相同的粪便,每组9颗,共63颗样本。分别放入无菌冻存管中保存,并迅速放入液氮后转入-80℃冰箱中,然后进行粪便DNA提取及浓度测定,随后进行肠道菌群的高通量测序实验。在灌胃结束后当天晚上对7组大鼠禁食不禁水,第二天在对大鼠进行麻醉后,进行腹主动脉取血,肝脏组织及回肠组织取材。实验最终进行以下指标的检测:(1)大鼠血液的生化指标:TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、BUN、Scr。(2)苏木精-伊红染色(HE)染色分别观察各组大鼠肝脏组织和回肠组织的病理变化。(3)16S高通量测序检测:通过提取大鼠粪便中的总DNA,分析肠道微生物的丰度及多样性,比较产生的菌群变化差异。
结果:1、大鼠血脂水平及肝肾功能结果变化:
1.1血脂四项变化:同正常组比较,模型组大鼠血脂四项TC、TG、LDL-C均见明显升高,HDL-C降低(P<0.01),说明高脂血症大鼠造模成功。同模型组比较,在药物干预8周后,血脂康组TC、TG明显下降(P<0.01),HDL-C显著性升高(P<0.05)、立普妥组TC、TG明显降低(P<0.01);中药低剂量组TC、TG显著降低(P<0.01);中药中剂量组TC、TG、LDL-C显著降低(P<0.01),差异具有统计学意义;中药高剂量组TC、TG显著降低(P<0.01),HDL-C明显升高(P<0.05),差异具有统计学意义;各用药组比较无统计学意义。说明解郁祛痰化浊方可明显改善高脂血大鼠血脂水平且效果与血脂康、立普妥疗效相当。
1.2肾功能变化:与正常组比较,模型组的尿酸明显升高(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,中药中剂量组大鼠血尿素氮、肌酐明显下降(P<0.05),差异具有统计学意义;中药高剂量组肌酐明显下降(P<0.01),差异具有统计学意义。其余各组没见明显差异。说明经过高脂饲料喂养后,大鼠肾功能出现异常。中药中、高剂量组均具有保护肾功能的作用。
1.3肝功能变化:与正常组比较,模型组的AST明显升高(P<0.01),差异具有统计学意义;与模型组比较,中药高剂量组AST明显下降(P<0.01),差异具有统计学意义;其余各组与模型组比较无统计学意义。说明经过高脂饲料喂养后,模型组的AST明显升高,大鼠肝功能出现异常。经过药物干预后,中药高剂量组保护肝功能作用明显。
通过HE染色观察各组大鼠肝脏组织、回肠组织,结果示:
2.1肝脏HE染色结果与模型组比较:与模型组比较,各用药组的肝细胞脂肪样变和炎症细胞浸润情况均有所改善。说明解郁祛痰化浊方可以减少肝脏脂肪变性和脂质沉积。
2.2回肠组织HE染色结果与模型组比较:与模型组比较,各用药组的回肠组织结构较模型组清晰,各组组织结构排列较整齐,结构较完整,提示经过药物干预后肠道黏膜的完整性有明显改善。说明解郁祛痰化浊方可以修复高脂饮食造成肠道黏膜的损伤,进而起到保护肠粘膜的作用。
基于高通量测序结果分析:与模型组比较,发现经过药物干预后,OTUs的数目种类都增加了,且中药中剂量组的OTUs数目明显高于其他组。组间进行比较,从门层次上看,正常组和模型组比较,模型组的变形菌门(Proteobacteria)丰度明显上升,正常组的拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度明显上升。从纲层次上看,正常组和模型组进行比较,正常组的拟杆菌纲(Bacterodia)、Bacilli(厚壁菌门)丰度明显上升,而梭菌(Clostridia )的丰度明显下降。模型组的ε-变形菌(Epsilonproteobacteria)的丰度明显上升。从属水平上看,模型组和用药组进行比较,模型组的布劳特氏属(Blautia)、Peptostreptococcaceae(消化链球菌科)、Erysipelotrichaceae(韦荣球菌科)、Clostridiaceae(梭菌科)丰度增加,用药组明显下降。中药中剂量组和高剂量组的瘤胃菌UCG-005(RuminococcaceaeUCG-005)与模型组比较丰度明显增加。各用药组与正常组比较毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)丰度明显增加。各用药组比较,经过中药干预后乳杆菌属(Lactobacillus)丰度显著增加。变性菌门、布劳特氏菌属(Blautia,梭菌科)等属于有害菌,而拟杆菌门(Bacteroidetes)、乳杆菌属(Lactobacillus)毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)等为有益菌,即经过中药干预后有益菌的数量显著提高,有害菌明显下降,而未经药物干预的模型组的有害菌数量增多。说明解郁祛痰化浊方能够增加肠道菌群的物种丰度及物种的多样性,富集有益菌群,抑制致病菌,进而改善高脂饮食大鼠的肠道菌群的结构。
结论:1、解郁祛痰化浊方对高脂血症大鼠的血脂有一定的干预作用,同时解郁祛痰化浊方能改善大鼠的肝肾功能,对肝肾有一定的保护作用。
2、解郁祛痰化浊方可以减少高脂血症大鼠肝脏的脂肪变性和脂质沉积,同时可以改善高脂饮食造成的肠道黏膜的损伤,保护肠粘膜。
3、通过16SrRNA高通量测序技术发现解郁祛痰化浊方可以增加肠道菌群的物种丰度和物种多样性,富集有益菌群,抑制条件致病菌,进而改善肠道菌群的结构。
方法:采用高脂饲料喂养的方法建立高脂血症大鼠模型,通过随机数字表的方法将体质量为200+20g的70只清洁雄性Wistar大鼠进行1周的适应性喂养后,称重,禁食12-16h后眼底静脉丛取血,检测生化指标,所有标本均符合要求,然后将70只大鼠随机抽取10只作为正常组,余60只大鼠作为模型组,正常组喂食正常饲料,0模型组喂食高脂饲料,喂养12周后建立高脂血症大鼠动物模型。然后把模型组大鼠随机分为以下6组,每组10只,即模型组,血脂康组,立普妥组,解郁祛痰化浊方低剂量组,解郁祛痰化浊方中剂量组,解郁祛痰化浊方高剂量组。正常组继续喂食正常饲料,模型组、血脂康组、立普妥组、解郁祛痰化浊方低剂量组、解郁祛痰化浊方中剂量组、解郁祛痰化浊方高剂量组给予高脂饲料喂养,同时正常组和模型组给予等量无菌蒸馏水灌胃,血脂康组给予血脂康0.1g/kg,立普妥组给予立普妥2mg/kg,解郁祛痰化浊方低剂量组给予0.4g/kg解郁祛痰化浊方,解郁祛痰化浊方中剂量组给予0.8g/kg解郁祛痰化浊方,解郁祛痰化浊方高剂量组给予1.6g/kg解郁祛痰化浊方灌胃,连续灌胃8周,在灌胃结束当天,由于取样的原因,先分别收集7组大鼠质地、大小相同的粪便,每组9颗,共63颗样本。分别放入无菌冻存管中保存,并迅速放入液氮后转入-80℃冰箱中,然后进行粪便DNA提取及浓度测定,随后进行肠道菌群的高通量测序实验。在灌胃结束后当天晚上对7组大鼠禁食不禁水,第二天在对大鼠进行麻醉后,进行腹主动脉取血,肝脏组织及回肠组织取材。实验最终进行以下指标的检测:(1)大鼠血液的生化指标:TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、BUN、Scr。(2)苏木精-伊红染色(HE)染色分别观察各组大鼠肝脏组织和回肠组织的病理变化。(3)16S高通量测序检测:通过提取大鼠粪便中的总DNA,分析肠道微生物的丰度及多样性,比较产生的菌群变化差异。
结果:1、大鼠血脂水平及肝肾功能结果变化:
1.1血脂四项变化:同正常组比较,模型组大鼠血脂四项TC、TG、LDL-C均见明显升高,HDL-C降低(P<0.01),说明高脂血症大鼠造模成功。同模型组比较,在药物干预8周后,血脂康组TC、TG明显下降(P<0.01),HDL-C显著性升高(P<0.05)、立普妥组TC、TG明显降低(P<0.01);中药低剂量组TC、TG显著降低(P<0.01);中药中剂量组TC、TG、LDL-C显著降低(P<0.01),差异具有统计学意义;中药高剂量组TC、TG显著降低(P<0.01),HDL-C明显升高(P<0.05),差异具有统计学意义;各用药组比较无统计学意义。说明解郁祛痰化浊方可明显改善高脂血大鼠血脂水平且效果与血脂康、立普妥疗效相当。
1.2肾功能变化:与正常组比较,模型组的尿酸明显升高(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,中药中剂量组大鼠血尿素氮、肌酐明显下降(P<0.05),差异具有统计学意义;中药高剂量组肌酐明显下降(P<0.01),差异具有统计学意义。其余各组没见明显差异。说明经过高脂饲料喂养后,大鼠肾功能出现异常。中药中、高剂量组均具有保护肾功能的作用。
1.3肝功能变化:与正常组比较,模型组的AST明显升高(P<0.01),差异具有统计学意义;与模型组比较,中药高剂量组AST明显下降(P<0.01),差异具有统计学意义;其余各组与模型组比较无统计学意义。说明经过高脂饲料喂养后,模型组的AST明显升高,大鼠肝功能出现异常。经过药物干预后,中药高剂量组保护肝功能作用明显。
通过HE染色观察各组大鼠肝脏组织、回肠组织,结果示:
2.1肝脏HE染色结果与模型组比较:与模型组比较,各用药组的肝细胞脂肪样变和炎症细胞浸润情况均有所改善。说明解郁祛痰化浊方可以减少肝脏脂肪变性和脂质沉积。
2.2回肠组织HE染色结果与模型组比较:与模型组比较,各用药组的回肠组织结构较模型组清晰,各组组织结构排列较整齐,结构较完整,提示经过药物干预后肠道黏膜的完整性有明显改善。说明解郁祛痰化浊方可以修复高脂饮食造成肠道黏膜的损伤,进而起到保护肠粘膜的作用。
基于高通量测序结果分析:与模型组比较,发现经过药物干预后,OTUs的数目种类都增加了,且中药中剂量组的OTUs数目明显高于其他组。组间进行比较,从门层次上看,正常组和模型组比较,模型组的变形菌门(Proteobacteria)丰度明显上升,正常组的拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度明显上升。从纲层次上看,正常组和模型组进行比较,正常组的拟杆菌纲(Bacterodia)、Bacilli(厚壁菌门)丰度明显上升,而梭菌(Clostridia )的丰度明显下降。模型组的ε-变形菌(Epsilonproteobacteria)的丰度明显上升。从属水平上看,模型组和用药组进行比较,模型组的布劳特氏属(Blautia)、Peptostreptococcaceae(消化链球菌科)、Erysipelotrichaceae(韦荣球菌科)、Clostridiaceae(梭菌科)丰度增加,用药组明显下降。中药中剂量组和高剂量组的瘤胃菌UCG-005(RuminococcaceaeUCG-005)与模型组比较丰度明显增加。各用药组与正常组比较毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)丰度明显增加。各用药组比较,经过中药干预后乳杆菌属(Lactobacillus)丰度显著增加。变性菌门、布劳特氏菌属(Blautia,梭菌科)等属于有害菌,而拟杆菌门(Bacteroidetes)、乳杆菌属(Lactobacillus)毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)等为有益菌,即经过中药干预后有益菌的数量显著提高,有害菌明显下降,而未经药物干预的模型组的有害菌数量增多。说明解郁祛痰化浊方能够增加肠道菌群的物种丰度及物种的多样性,富集有益菌群,抑制致病菌,进而改善高脂饮食大鼠的肠道菌群的结构。
结论:1、解郁祛痰化浊方对高脂血症大鼠的血脂有一定的干预作用,同时解郁祛痰化浊方能改善大鼠的肝肾功能,对肝肾有一定的保护作用。
2、解郁祛痰化浊方可以减少高脂血症大鼠肝脏的脂肪变性和脂质沉积,同时可以改善高脂饮食造成的肠道黏膜的损伤,保护肠粘膜。
3、通过16SrRNA高通量测序技术发现解郁祛痰化浊方可以增加肠道菌群的物种丰度和物种多样性,富集有益菌群,抑制条件致病菌,进而改善肠道菌群的结构。