芥子气中毒标志物硫二甘醇的现场即时检测方法研究

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芥子气(Sulfur mustard,SM)作为最具有代表性的化学战剂(Chemical warfare agents,CWA),常常被恐怖组织使用或者在战争中大规模使用,引起了人们的广泛关注。SM中毒的患者往往会出现皮肤糜烂,眼睛受伤、失明等症状,甚至会因为呼吸系统衰竭而导致死亡,由于其具有高稳定性、难分解、缺乏解毒剂和易于合成的特性,严重威胁人们的健康与生命安全。在SM受害者的血液、尿液及皮下组织中都会产生一定量的相对稳定、低挥发性和低毒性的代谢产物硫二甘醇(Thiodiglycol,TDG),而在没有中毒的人体内也会有少量TDG存在,它在正常人尿液中浓度范围在0-1 ng/m L,而SM中毒患者尿液中TDG浓度通常超过10ng/m L,所以TDG既是SM的主要水解产物,也是SM在中毒者体内的代谢标志物。目前已将检测TDG确定为SM中毒的临床诊断方法之一,为临床检验提供依据。现有TDG的检测方法主要是基于色谱分析方法,所需仪器局限于实验室。因此,设计一种快速、简单且实用性强的TDG的现场即时检测(Point-of-care testing,POCT)方法无论在医学诊断、环境安全还是国家安全领域都具有十分重要的意义。本文利用分子印迹技术(Molecularly imprinted technology,MIT)合成对TDG具有高选择性和高亲和力的分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers,MIPs),以金纳米颗粒(Gold nanoparticles,AuNPs)为信号报告单元,构建TDG的POCT方法,该方法具有操作简便、成本低廉、不需要使用大型设备等优点,有望用于SM中毒的快速诊断,为临床救治提供依据。具体研究内容包括以下两个方面:(1)合成了一种以水为致孔剂的MIPs用于高特异性捕获靶物TDG,模板分子TDG与功能单体α-甲基丙烯酸在水溶液中形成预组装溶液,通过交联剂和引发剂的作用下,在硝酸纤维素膜表面形成规则分散的网状结构。随后在合适的洗脱液的作用下,将模板分子去除,在聚合物膜表面留下相应的结合位点,得到分子印迹试纸条(Molecularly imprinted test strips,MITS)。由于TDG具有硫原子,可以与AuNPs形成牢固的Au-S键,因此当带有大量空腔的MITS特异性吸附TDG分子后,会吸附大量的AuNPs而呈现出肉眼可见的AuNPs的红色,从而实现了TDG的可视化检测,并用三原色分析软件Image-Pro Plus进行后续分析。研究表明,当TDG与MAA浓度的比值为1:2时可形成良好的非共价键作用,三氯甲烷为最优洗脱剂,洗脱时间为50min时可获得最佳洗脱效果,AuNPs与TDG作用50 min后可得到最佳结果,TDG与MIPs的特异性识别15 min后可得到最佳结果,30℃为最佳孵育温度。MITS的颜色变化与TDG浓度在1.0 ng/m L到100.0μg/m L间具有良好的线性关系,检测限为0.23 ng/m L。由于该方法具有优异的选择性和抗干扰能力,并且已用于尿液中TDG的检测,可以实现对SM中毒诊断。(2)由于上述方法在洗脱的过程中可能导致MIPs损失或者分散性差的问题,而静电纺丝纳米纤维具有比表面积大、孔隙率高、均一性好和三维网状结构的优势,因此我们进一步设计和构建了一种新型的分子印迹电纺丝纳米纤维膜。在该工作中,我们以静电作用为驱动力,将带有负电且已去除掉模板分子的MIPs组装到带正电性的PEI/PVA电纺纳米纤维表面,裁剪整齐即得到MIPs/PEI/PVA纳米纤维膜。同样由MIPs对TDG进行捕获,AuNPs作为信号报告单元,进而产生肉眼可见的红色。为了进一步降低检测限,提高灵敏度,采用银染增强的方法使得AuNPs的酒红色颜色加深,并用软件Image J读取灰度值进行后续分析。研究表明,当电纺时间为100 min,MIPs的浓度为80 mg/m L,TDG与金胶溶液作用时间为2h以及缓冲体系p H=6时,能获得最佳的信号值。MIPs/PEI/PVA纳米纤维膜的颜色变化与TDG浓度在0.1 ng/m L到1.0μg/m L间具有良好的线性关系,检测限为38 pg/m L,最终实现了尿样中TDG的快速、灵敏检测。
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