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塞内卡谷病毒（Seneca Valley Virus,SVV）是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科塞内卡病毒属。近年发现SVV感染与猪的散发性水疱性疾病（PIVD）相关,各年龄段的猪均易感,临床表现主要为跛行和水泡,7日龄内新生仔猪死亡率高达30%～70%。作为一种严重危害养猪业的新发传染病,目前尚无有效的商品化疫苗和抗病毒药物。因此,开展关于SVV的抗病毒研究,寻求有效的预防措施和治疗方法是当务之急。胆固醇-25-羟化酶（CH25H）是一种干扰素刺激因子（ISG）,通过催化作用于胆固醇的第25个碳原子添加第二个羟基来催化胆固醇从而生成25-羟基胆固醇（25HC）。近期研究表明,CH25H和25HC是广谱的抗病毒宿主因子,在宿主抗病毒天然免疫应答中发挥着重要作用。为了探讨CH25H对SVV增殖的影响极其相关的分子机理,本研究以SVV临床分离毒株SVV-HB为研究对象,开展了以下的研究内容:1.CH25H对SVV-HB复制的影响研究CH25H是一个干扰素刺激因子,是否对干扰素敏感的SVV-HB复制过程中发挥调控作用并不清楚。为此评价了SVV-HB感染对内源性CH25H表达的影响,将1.0 MOI SVV-HB分别感染HEK-293T和BHK-21细胞,在指定的时间点收集细胞样品,通过western blot和q RT-PCR检测蛋白表达和m RNA表达水平。结果显示,SVV-HB感染细胞后不同时间点CH25H的蛋白表达水平持续下降,12h时蛋白下降的百分比达到了48%;CH25H的m RNA表达水平皆呈现极显著降低（***P＜0.001）。由此推测,SVV-HB可能通过下调CH25H表达促进自身复制并在宿主感染致病中发挥一定作用。为了确定CH25H对SVV-HB增殖的影响,首先用1.0MOI SVV-HB感染过表达mCH25H（鼠源CH25H）的HEK-293T细胞系,通过western blot,q RT-PCR和病毒噬斑实验分析SVV-HB增殖的情况。结果表明,mCH25H过表达组与对照组相比VP1蛋白表达水平降低;感染后9h,VP1的m RNA表达相对下降水平达到了极显著（***P＜0.001）,相对病毒滴度减少约三倍（***P＜0.001）。进一步研究发现,mCH25H呈剂量依赖性地抑制SVV-HB增殖。鉴于SVV-HB在人类溶瘤治疗中的潜力和猪群流行病治疗方面,同时在HEK-293T细胞中评价了人源（h CH25H）和猪源（s CH25H）对SVV-HB增殖的影响,结果显示均能抑制SVV-HB增殖,表明CH25H对SVV-HB的抑制效应不存在种属特异性。为了进一步确定CH25H对SVV-HB增殖的抑制效应,利用shRNA敲低HEK-293T细胞中CH25H表达后再感染SVV-HB,结果显示相较于对照组,VP1蛋白水平表达量上调,表明沉默CH25H基因的表达可以促进SVV-HB的增殖。2.CH25H抑制SVV-HB复制的分子机制研究上面结果表明CH25H可以有效抑制SVV-HB增殖,而CH25H可通过不同机制影响不同病毒的增殖,为了探究CH25H抑制SVV-HB复制的分子机制研究,首先评价了CH25H的酶活性在其抑制SVV-HB增殖中的作用。为此构建了mCH25H缺乏羟化酶活性的突变体（mCH25H-M）,在HEK-293T和BHK-21细胞中分别转染mCH25H,mCH25H-M和对照质粒后,SVV-HB感染细胞9h后收样,通过western blot和病毒噬斑法评价mCH25H-M对SVV-HB增殖的影响,结果显示缺乏羟化酶活性后完全失去了抑制病毒增殖作用,表明CH25H抑制SVV-HB的增殖依赖其酶活性。研究表明CH25H通过催化胆固醇生成25HC影响病毒的增殖,为了探究CH25H是否可通过依赖25HC影响SVV-HB增殖,在BHK-21细胞中直接施用25HC,筛选出合适作用浓度后,继而感染SVV-HB（1 MOI）,分别检测感染后不同时间点样品,western blot结果显示VP1蛋白表达水平在施用25HC后有2～5倍的降低水平。5=25HC对SVV-HB抑制效应最强,VP1 m RNA表达水平和病毒滴度显著下降（***P＜0.001）。为了进一步探究25HC抑制SVV-HB的分子细节,我们进一步分析了25HC是否可以直接杀伤病毒粒子,通过病毒灭活实验分析,发现25HC并不可以直接杀伤病毒粒子。进而分析了25HC在病毒复制的哪个阶段发挥作用。通过病毒吸附试验,进入实验,复制实验和释放实验,发现25HC仅在病毒吸附阶段发挥效应,施用25HC对比对照组,病毒滴度和m RNA水平皆极显著降低（***P＜0.001）。本研究表明不同种属的CH25H均能有效抑制SVV-HB的增殖,并揭示了CH25H抑制SVV增殖的分子机制。以上结果,为后续SVV感染免疫以及抗病毒药物设计提供新的思路,为新型疫苗研发和溶瘤病毒的设计等奠定基础。