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长期以来,在原核生物系统中预测调控因子结合位点(Transcriptional FactorBinding Sites,TFBS)一直是极富挑战性的一个课题。为了建立调控位点的生物信息学预测方法,本文选取了假单胞菌属中的LysR家族转录调控因子(LysR TypeTramcriptioml Regulators,LTTRs)进行研究。本属内菌株用于生物信息学分析的优势十分明显:一方面在进化上具有相关性,亲缘关系显著;另一方面基因组和信号转导系统差异性明显,基因的水平转移和适应性进化常见,代谢通路具备复杂的多样性。这种内在的进化相关性和序列多样性既保证了待分析菌株内同源基因调控关系的真实存在,又为生物信息学分析提供了必要的序列水平差异以供分析。LXTRs的靶基因容易确定,结合位点序列特征明显,歧化基因转录方式保守,分析预测运算量较小,也利于生物信息学方法预测。 本文首先根据NCBI注释,找出已测序假单胞菌属内LTTRs及其同源基因,获得它们所调控的歧化基因上游序列,对这些潜在调控区域使用比较基因组学进行保守位点预测。本方法最大的优势在于,能够在完全没有实验结果支持的情况下预测一个调控蛋白的结合位点。文章首先使用“干”的方式预测了TrpI和CatR两个转录因子的结合位点,并与前人DNase Footprinting等“湿”实验的位点进行比对。结果表明,在选取p-value=10E-07作为搜索阈值时,得到的位点结果较为可信。以上结果预示着在确定的阈值下使用本方法在假单胞菌属中预测LTTR结合位点的可行性。 在第二章方法的基础上,本文首先预测了假单胞菌属内部分LTTR的结合位点;继而将同源基因对的选取由假单胞菌属拓展到含有歧化转录同源基因对的近缘菌属中,并将两种方法预测的结果进行对比,指出各自适应的分析对象及优势所在。 本文还使用生物化学和分子生物学方法对MexT结合位点的预测结果进行了实验验证。MexT是铜绿假单胞菌中一个与耐药性机制密切相关的LysR家族蛋白,对其歧化转录基因mexS产生正向调控作用。本章对mexS启动子上游预测的MexT结合位点进行了单碱基突变,并检测突变型启动子和野生对照在MexT激活下的表达水平,证明MexT的结合/激活能力确实在关键位点碱基突变后受到影响;凝胶阻滞实验也显示MexT可以结合于mexT-mex基因间隔区,从而进一步为本论文LTTR结合位点预测方法提供了实验验证。实验部分由本实验室一年级学生朱曼璐完成。 本论文建立的方法为转录因子位点的确定提供了一个有效的分析工具,对调控蛋白机理研究具有十分重要的指导意义,一方面可以将已知蛋白结合位点及调控信息推广应用于新测序基因组中;另一方面也有助于在已知或未知基因组中寻找新的编码基因及转录岛;还有助于深入分析假单胞菌属特有的代谢机制,如嗜铁蛋白的调控与分泌、绿脓素的分泌、群体感应系统、抗生素降解酶类和外排泵系统等热点课题。