研究背景及目的意义迄今为止,同种异体器官移植仍是挽救终末器官衰竭患者生命的首选治疗手段,而移植物能否存活是延长患者生命的重要前提。目前已知影响移植物生存的最重要因素是同种移植后必然发生的移植排斥反应,其中急性移植排斥的发生率最高,严重影响移植器官的生存。随着新型免疫抑制剂的不断发现和应用,移植物的急性排斥发生率明显降低,生存期不断延长,但文献报道移植物长期存活状况并无明显改善,相关的机理目前尚未完全阐明,研究提示与急性排斥发生的有效控制有关。临床研究表明,早期发现和及时干预同种急性移植排斥,可明显改善移植物生存状况和患者预后。因此,深入研究与同种急性排斥密切相关的新的生物学标志分子,探讨其作用的分子机理,对同种移植急性排斥反应的早期诊断和及时治疗,对于延长同种移植物的生存及改善患者预后都有非常重要的理论和实际意义。同种移植排斥反应可分为超急性排斥、急性排斥和慢性排斥三大类。其中急性排斥反应的发生机理主要是机体T淋巴细胞识别同种移植物抗原后克隆增殖、分化,引发一系列促炎性细胞因子的分泌,从而造成移植物损伤。深入研究同种效应T细胞增殖分化和同种排斥关键炎性细胞因子的分泌已成为有效控制同种移植急性排斥的重要课题。本实验室既往研究表明,CD4+T细胞可直接引起同种移植急性排斥反应,在所建立的同种及同系效应CD4+T细胞基因差异文库（Serial Analysis Gene Expression,SAGE）中,STAT1 是差异最大的基因,同种组比同系组高10倍。STAT1上游的白细胞介素27受体α（IL-27rα）及IFN-γ受体1（Ifngr1）在同种组的表达也显著增高。其中IFN-γ显著促进同种移植排斥的作用已经获得公认,而同样高表达的白细胞介素27受体α（Interleukin 27 receptor α,IL-27Rα）在同种移植急性排斥的作用鲜见报道。近年研究表明,IL-27R由特异性亚单位IL-27Rα（又称WSX-1）及gp130组成,其特异配体是IL-27,由EBI3及特异性亚单位p28组成。IL-27主要是通过影响细胞因子表达谱和诱导免疫细胞分化参与炎症应答。一方面,IL-27通过激活IL-27Rα,释放促炎性细胞因子,如IFN-y、IL-6等的分泌;可增强抗原提呈细胞树突细胞（Dendritic Cells,DC）的抗原处理递呈能力,刺激CD4+T细胞增殖,促进Th1型细胞应答。另一方面,IL-27也可促进抑炎性IL-10的分泌,减轻气道炎症;可通过促进Foxp3+Treg功能,抑制T细胞增殖,,抑制炎症反应。然而,迄今为止尚未见有关IL-27/IL-27Rα通路在同种移植急性排斥中作用的研究报道。本论文通过4个部分研究了 IL-27Rα在同种移植急性排斥中的作用、分子机制及作为体内移植物急性排斥生物学标志的意义。论文首先对同种移植小鼠模型IL-27Rα及IL-27的表达及细胞定位进行了研究,探讨其在同种移植排斥中的作用;第二部分研究了 IL-27Rα细胞信号通路激活后引起的下游分子改变,探讨其作用的分子机理和细胞信号通路;第三部分针对其在急性排斥期移植物高表达的特点,制备了靶向IL-27Rα的放射性核素标记单抗分子探针,通过在体全身动态磷屏自显影显像及靶向性分析,研究其是否可作为早期提示移植物急性排斥的发生的特异性生物学标志;第四部分,利用基因重组IL-27（recombinant IL-27,rIL-27）,制备了靶向IL-27Rα的小分子受体显像探针,研究其体内靶向同种排斥移植物的能力及特征。本论文研究结果为阐明IL-27Rα在同种移植排斥中作用及分子机制提供了重要实验依据,对利用核素分子显像在体靶向IL-27Rα监测同种移植物急性排斥提供了新的策略,对靶向IL-27Rα诱导同种移植耐受,延长同种移植物生存期提供了重要实验依据,展现了良好的应用前景,研究内容具有重要意义。第一部分 同种排斥过程中IL-27Rα+细胞表达及对炎性细胞因子分泌的影响研究方法1.同种及同系小鼠皮片移植模型的建立及移植物生存期观察:常规建立小鼠皮片移植模型。同种及同系移植受体小鼠均为BALB/c,供体小鼠分别为C57BL/6和BALB/c。移植后逐日观察移植物生存状况,确定不同移植模型中移植物的生存期。2.移植皮片H＆E/免疫组化染色及Western Blot分析:移植后第1、7、10、14和21天,分离同种及同系移植皮片,制作组织切片。H＆E染色后,镜下观察移植皮片细胞浸润及排斥状况,确定排斥高峰期。通过IL-27Rα免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）染色和Western Blot分析同种移植急性排斥期移植物IL-27Rα蛋白表达状况。通过IL-27免疫组化染色、Western Blot及ELISA分析IL-27蛋白水平。3.移植皮片IL-27Rα/CD3/CD4/CD68免疫荧光染色:移植后第10天（同种急性排斥高峰期）分离移植皮片,分别进行IL-27Rα与CD3、与CD4、与CD68免疫荧光（Immunofluorescent,IF）染色,分析同种移植急性排斥期移植物CD3+T细胞,CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞IL-27Rα表达状况。4.移植受体脾IL-27R α与CD3/CD4阳性T细胞的流式细胞术分析:移植后第10天分离移植受体鼠脾细胞,进行CD3-PE-Cy7、CD4-FITC、IL-27Rα-PE抗体的细胞表面蛋白荧光染色,分析同种急性排斥期脾CD3+和CD4+T细胞的IL-27Rα表达状况。5.移植皮片IL-27与CD11c/CD3/CD68 阳性细胞免疫荧光染色:移植后第10天分离移植皮片,分别进行IL-27Rα与CD11c、与CD3、与CD68的荧光双染,研究移植皮片的CD11c+细胞,CD3+T细胞和CD68+巨噬细胞中IL-27分泌状况。6.IL-27Rα+细胞过继促进同种移植排斥的研究:建立同种移植SCID小鼠模型（SCID-BALB/c小鼠为受体,C57BL/6小鼠为供体）,待移植部位愈合后,分别过继输注同种效应脾细胞及经流式细胞术中分选出的同种效应脾IL-27Rα+细胞,观察SCID模型中同种移植皮片的生存期。在排斥高峰期,分离移植皮片进行H＆E染色及IL-27Rα荧光染色,分析同种急性相排斥状况及移植物局部浸润的细胞类型。7.同种移植排斥相关细胞因子表达的分析:对移植后第10天的同种及同系移植皮片进行IL-27Rα和IFN-γ及IL-10荧光双染,分析同种急性排斥反应中IL-27Rα阳性细胞IFN-γ和IL-10分泌状况。同时利用ELISA检测血清同种移植排斥过程中IFN-γ、IL-10和IL-27的分泌状况,研究急性排斥期相关细胞因子表达的改变。研究结果1.同种移植后不同时间移植皮片IL-27R α/IL-27表达状况:同种移植皮片在移植后第9天出现排斥,最晚排斥时间为第13天,中位生存期为1 1天。同系皮片未发生排斥。免疫组化染色及Western Blot均证实,移植后第10天同种排斥达到高峰期时,移植皮片IL-27Rα表达量最高,显著高于其他时间点及同时间点的同系移植皮片。此时同种移植皮片的IL-27表达最高。2.CD3+/CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞的IL-27R α表达状况:CD3+/CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞的细胞膜上均表达IL-27Rα移植后第10天,同种移植组的脾IL-27Rα+CD3+T细胞比例及IL-27Rα+CD4+T细胞比例显著高于同系移植组。3.CD3+T细胞/CD68+巨噬细胞和CD11c+细胞IL-27分泌状况:移植后第10天的移植物CD1 1c+细胞可检测到IL-27分泌,但CD3+T细胞及CD68+巨噬细胞未检测到IL-27分泌。4.IL-27R α阳性细胞单独过继可促进同种移植排斥反应:SCID同种移植模型中分别过继同种效应脾细胞及经流式细胞术中分选的纯IL-27Rα+细胞后,同种移植皮片均发生明显排斥,其中分选的IL-27Rα+细胞单独过继组的排斥时间明显早于混合脾细胞过继组,移植物生存期短。细胞过继后第14天,单独IL-27Rα+细胞过继组的移植皮片有大量炎性细胞浸润,免疫荧光染色证实主要是IL-27Rα+细胞。5.IL-27Rα表达对IFN-γ/IL-10和IL-27表达的影响:同种移植排斥高峰期,移植物IL-27Rα+细胞的IFN-γ分泌显著增多,而IL-10分泌显著降低。与此一致的是模型鼠在同种排斥高峰期,血清IFN-γ、IL-27浓度明显增高,而IL-10浓度显著降低。第二部分 IL-27Rα活化对同种移植排斥反应影响的分子机理研究方法1.混合淋巴细胞培养:刺激组中,同种刺激细胞源于C57BL/6小鼠,同系刺激细胞源于BALB/c小鼠。同种反应细胞组源于BALB/c小鼠。常规制备单个脾细胞悬液。分别将刺激组细胞用丝裂霉素处理后与反应细胞混合后,常规培养。2.rIL-27对同种反应脾细胞增殖的影响:利用不同浓度的rIL-27对同种及同系混合脾细胞分别刺激72h,然后利用CCK8试剂盒测细胞增殖,确定rIL-27最佳作用浓度。然后,将rIL-27（25ng/ml）加入同种混合脾细胞培养中作用24h、48h及72h,利用CCK8试剂盒测细胞增殖状况。最后,在加入25ng/ml rIL-27的混合脾细胞培养中,分别加入JAK抑制剂Ruxolitinib、STAT抑制剂SH-4-54及IL-27 p28封闭抗体。72h后,CCK8法测细胞增殖状况。3.r IL-27对同种反应脾细胞凋亡的影响:将同种混合脾细胞与25ng/ml rIL-27、0.12μM Ruxolitinib、1.5μM SH-4-54 及 7.5μg/ml抗 IL-27 p28 抗体分别共孵育 72h后,Western blot测抗凋亡蛋白Bcl-xL及Pim2的表达,流式细胞术测细胞凋亡状况。4.rIL-27对细胞信号通路STAT1/STAT3/STAT5的影响:同种和同系脾细胞分别混合培养 72h 后,加入 rIL-27（25ng/ml）0.25h、0.5h、1h、2h、24h 后,测 STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化及总蛋白的表达。同种脾细胞混合培养72h后,加入0.012、0.12、1.2μM Ruxolitinib,或加入 0.15、1.5、15μM SH-4-54 处理 24h,然后与 25ng/mlrIL-27 共孵育 0.25h,测 STAT1、STAT3、STAT5 的磷酸化改变。将同种混合培养脾细胞分别与25ng/ml rIL-27、0.12μM Ruxolitinib、1.5μM SH-4-54 及 7.5μg/ml 抗 IL-27 p28 抗体共孵育 72h,测 STAT1、STAT3 和 STAT5总蛋白的表达。5.同种急性排斥期STAT1/STAT3/STAT5表达活化状况:建立小鼠同系及同种皮肤移植模型。分离移植后第10天的移植皮片,制备成石蜡切片。用Western Blot及免疫组化染色进行STAT1/STAT3/STAT5表达的分析。进行IL-27Rα及与p-STAT1、与p-STAT3、与p-STAT5的免疫荧光染色,检测IL-27Rα+细胞中磷酸化STAT1/STAT3/STAT5表达状况。研究结果1.rIL-27对同种反应脾细胞增殖的影响:随着rIL-27浓度增加,同种反应脾细胞增殖明显增强。25ng/ml rIL-27在24h即显示出明显促增殖作用,加入JAK/STAT 抑制剂（Ruxolitinib/SH-4-54）及抗 IL-27p28 单抗后,rIL-27 促增殖作用受到明显抑制。2.rIL-27对同种反应脾细胞凋亡的影响:rIL-27抑制同种反应脾细胞凋亡,促进抗凋亡分子Pim2、Bcl-xL蛋白的表达。分别加入Ruxolitinib、SH-4-54及抗IL-27 p28单抗抑制后,rIL-27抗凋亡效果明显降低。3.rIL-27对同种反应脾细胞STAT1/STAT3/STAT5通路的影响:25ng/ml rIL-27作用24h可明显促进同种反应脾细胞中STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化,并增强STAT1、STAT3和STAT5蛋白的表达。4.同种急性排斥期STAT1/STAT3/STAT5的表达状况:同种移植急性排斥期移植物STAT1、STAT3和STAT5蛋白显著高表达。在IL-27Rα+细胞中检测到STAT1/STAT3/STAT5磷酸化蛋白表达。第三部分 125I-anti-IL-27R α mAb制备及靶向监测同种移植排斥的研究研究方法1.小鼠皮片移植模型的建立及IL-27Rα表达分析:常规建立同种及同系小鼠皮片移植模型。受体均为BALB/c小鼠,同种及同系组供体分别为C57BL/6和BALB/c小鼠。移植后第6、8、10、12和14天,Western Blot法检测移植皮片IL-27Rα蛋白表达状况。RT-PCR法检测移植皮片IL-27Rα mRNA表达状况。2.放射性核素标记探针制备及鉴定:Iodogen法常规制备125I-anti-IL-27Rα mAb及125I-IgG对照。进行标记率和放化纯分析。研究125I-anti-IL-27Rα mAb及125I-IgG在24h、48h和72h的稳定性。3.饱和实验及竞争结合分析:制备同种移植排斥高峰期（移植后第10天）的模型小鼠脾细胞悬液。以同系移植组作为对照。进行125I-anti-IL-27Rα mAb与同种或同系效应细胞的饱和及竞争结合实验。4.全身磷屏自显影显像:同种移植急性排斥高峰期（移植后第10天）,模型小鼠注射标记探针后,通过全身磷屏自显影显像观察同种及同系组125I-anti-IL-27RαmAb、125I-IgG及anti-IL-27Rα mAb阻断组的小鼠移植皮片的放射性浓聚状况及移植物核素分子影像。移植后第6和第8天（移植排斥早期）,注射125I-anti-IL-27RαmAb后,观察同种移植物放射性特异性浓聚状况并进行半定量分析。同时分别对离体移植皮片和对侧皮肤进行磷屏放射性自显影显像,确认其放射性浓聚是否具有高选择性。5.体内生物学分布研究:同种排斥高峰期（移植后第10天）,注射125I-anti-IL-27RαmAb探针48h后,进行生物学分布研究,计算T/NT（靶/非靶）比值。同时研究排斥早期即第6、8天的模型小鼠体内生物学分布并计算T/NT 比值。6.移植物125I-ant i-IL-27R α mAb探针的摄取与IL-27R α表达的相关性分析:将移植后第6、8、10天的同种及同系小鼠模型磷屏显像的放射性活度比值（移植物和对侧正常皮肤的放射性活度比值）与同时间点移植皮片IL-27Rα蛋白表达分别进行相关性分析。研究结果1.同种移植急性排斥期移植物IL-27R α的表达特点:与同系移植组相比,同种组排斥高峰期（第10天）,移植物的IL-27Rα蛋白表达水平最高。同时,同种排斥早期（第6、8天）,移植物的IL-27Rα蛋白表达水平也较高。同种排斥高峰期（第10天）,同种移植物的IL-27RαmRNA表达明显高于对侧皮肤和同系移植皮片。2.125I-anti-IL-27Rα mAb及125I-IgG制备及鉴定:成功制备125I-anti-IL-27RαmAb及同种型对照125I-IgG,放化纯分别为96.87%、96.86%。稳定性研究结果显示,直至72h标记物稳定性仍保持在90%以上。3.125I-anti-IL-27Rα mAb与细胞的饱和实验及竞争结合分析:同系脾细胞的Bmax值为2041 cpm/106个细胞,Kd值为13.09nM,而同种脾细胞为4824 cpm/106个细胞,Kd值为13.84nM。同种组的Bmax值显著高于同系组,而Kd值二者之间无明显差异。加入过量未标记的anti-IL-27Rα mAb可明显抑制125I-anti-IL-27RαmAb与同种效应脾细胞的特异性结合。4.全身磷屏自显影显像:在同种排斥高峰期,125I-anti-IL-27Rα mAb注射后24h、48h和72h的磷屏自显影显像结果表明,与同系组相比,同种组的移植皮片部位有明显放射性浓聚,并显著高于125I-IgG对照组及抗体封闭组。预先注射过量封闭抗体可明显阻断同种移植皮片125I-anti-IL-27RαmAb的浓聚。同种移植皮片48h的放射性活度显著高于对侧,显像最清晰。在同种排斥早期,即移植后第6、8天的显像中,同种移植皮片的125I-anti-IL-27Rα mAb放射性浓聚明显高于同系组。5.标记探针生物学分布研究:标记探针主要经过肝肾代谢。同种移植皮片对125I-anti-IL-27Rα mAb的摄取值最高,显著高于同系移植皮片及对侧皮肤。同种组的T/NT 比值显著高于同系组、125I-IgG组及封闭组。6.移植物125I-anti-IL-27Rα mAb的摄取与IL-27Rα表达的相关性分析:同种移植后第6、8、10天的全身磷屏自显影显像的放射性活度比值与同时间点移植皮片IL-27Rα蛋白表达均呈高度正相关（r=0.9719,P＜0.01）。第四部分IL-27Rα受体靶向的核素标记探针制备及在体监测同种排斥的研究研究方法1.小鼠同种及同系皮片移植模型构建方法同第三部分。2.放射性核素探针制备及鉴定:Iodogen法常规制备125I-rIL-27。进行标记率、放化纯分析,研究125I-rIL-27在1h、12h和24h的稳定性,对标记物进行亲水亲脂性分析。3.细胞饱和实验及竞争结合分析:分离同种排斥高峰期（移植后第10天）小鼠脾,并以同时间点同系移植组的脾为对照,制备单个细胞悬液。研究125I-rIL-27与同种效应脾细胞的饱和结合能力及竞争结合能力。4.全身磷屏自显影显像:实验分为三组:同种组、同系组和预先注射未标记抗IL-27Rα抗体封闭同种组。给三组小鼠注射125I-rIL-27,于1h、6h、12h和24h后,对三组小鼠及移植皮片行全身磷屏自显影显像及离体磷屏自显影显像并进行半定量分析。5.体内生物学分布研究:模型小鼠注射125I-rIL-27 24h后,进行体内生物学分布研究,计算T/NT（移植皮片/对侧皮片）及T/B（靶/血）比值。6.标记探针血液清除率分析:移植模型小鼠分别注射125I-rIL-27和125I-anti-IL-27Rα mAb后,不同时间点取尾静脉血进行血液清除率分析,计算血液清除率。7.移植物125I-rIL-27的摄取与IL-27Rα表达的相关性分析:对同种及同系移植模型小鼠的移植皮片磷屏自显影显像的放射性活度（DLU/mm2）与移植皮片IL-27Rα蛋白表达进行相关性分析。研究结果1.125I-rIL-27鉴定:成功制备125I-rIL-27,放化纯为93.28%。24h稳定性仍保持在在90%以上。亲脂亲水分析表明125I-rIL-27分子探针具有亲水性。2.125I-rIL-27与同种效应脾细胞的饱和结合实验和竞争结合实验:同系效应脾细胞的Bmax值为1607 cpm/106个细胞,Kd值为49.04nM。同种效应脾细胞Bmax值明显高于同系组,为2545 cpm/106个细胞,而Kd值为48.59nM,与同系组无明显差异。加入未标记的抗IL-27Rα mAb可显著阻断125I-rIL-27与同种效应脾细胞的特异性结合。3.全身磷屏自显影显像:注射125I-rIL-27 6h后,同种移植物即可见较明显放射性浓聚,24h时可见清晰的放射性浓聚。给予过量未标记的抗IL-27Rα抗体预先注射,可明显降低同种移植物的放射性浓聚。与125I-anti-IL-27RαmAb注射组相比,125I-rIL-27注射组小鼠模型的血液本底较低,靶组织显像明显。4.生物学分布研究:核素标记探针主要通过肝肾代谢。同种移植皮片对125I-rIL-27分子探针的摄取最高,显著高于同系移植皮片及对侧皮肤。同种组的T/NT值及T/B值显著高于同系组。5.标记探针血液清除率分析:与125I-anti-IL-27Rα mAb注射组相比,125I-rIL-27注射组在同种移植急性排斥模型小鼠血中滞留时间更短,血液清除率更快。6.移植物125I-rIL-27摄取与IL-27Rα表达的相关性分析:结果表明同种模型移植皮片磷屏自显影显像放射性活度与移植皮片IL-27Rα蛋白表达呈高度正相关（r=0.7169,P＜0.05）。结论1.同种急性排斥反应中,移植物及脾高表达IL-27Rα,表达细胞主要是CD3+T细胞和CD68+巨噬细胞。IL-27Rα+细胞过继转输可导致并加速同种移植排斥反应。2.CD3+IL-27Rα+细胞及CD68+IL-27Rα+细胞可促进IFN-γ分泌,降低IL-10分泌。CD11c+细胞可分泌IL-27。3.激活IL-27Rα可通过STAT1/3/5细胞信号途径上调同种反应细胞增殖,增加抗凋亡分子表达,抑制同种反应细胞凋亡。4.成功制备125I-anti-IL-27Rα mAb,体外可与同种效应细胞IL-27Rα特异性结合,磷屏自显影显像显示标记探针在体内可特异性靶向同种移植物,可在早期提示同种急性排斥反应。5.成功制备靶向IL-27Rα小分子受体显像分子探针125I-rIL-27,体外可与同种效应细胞IL-27Rα特异性结合,体内磷屏自显影显像可特异性显示同种移植物的急性排斥。具有血液清除快,显像本底低的特点。创新点1.同种移植物急性排斥期IL-27Rα高表达,IL-27Rα阳性细胞过继转输可导致同种移植排斥。2.IL-27Rα阳性细胞通过增强CD3+T细胞和CD68+巨噬细胞IL-27Rα表达,促进抗凋亡蛋白表达,促进细胞信号通路STAT1/3/5磷酸化,促进IFN-γ分泌和降低IL-10分泌,从而发挥促同种排斥作用。3.成功制备两种靶向IL-27Rα的放射性核素标记探针,体外实验和体内小鼠同种移植模型在体磷屏自显影显像和生物学分布研究证实,两种探针均可特异性靶向同种移植物,移植物局部放射性浓聚与IL-27Rα表达高度正相关,提示IL-27Rα有望成为在体监测同种移植急性排斥的新的分子靶点。