多发性骨髓瘤(MM)是血液系统最常见的恶性肿瘤之一,以单克隆浆细胞恶性增殖并分泌大量单克隆免疫球蛋白为特征,骨髓瘤患者易发生髓外浸润,累及软组织,晚期可有广泛性转移,较多见于脊柱,患者预后极差。Twist1是属于基本螺旋-环-螺旋(b HLH)蛋白家族的一种转录因子,在胚胎发育,尤其是中胚层的形成及分化中发挥着重要作用。此外,Twist1在肿瘤细胞增殖、衰老凋亡、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、肿瘤微环境、转移、干细胞样细胞的形成、血管新生、肿瘤细胞耐药等方面发挥重要作用。研究证明在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌等上皮性肿瘤以及胶质瘤、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、急性髓系白血病、慢性淋巴细胞性白血病、部分恶性淋巴瘤等非上皮性肿瘤中,发现Twist1高表达,且其表达与肿瘤的进展、转移及患者预后不良相关。在癌中,Twist1通过减弱上皮性基因的表达,增强间叶源性基因的表达,导致上皮间质转化,使上皮细胞获得运动、迁移等间叶细胞的特征,从而促进肿瘤的侵袭和转移。肿瘤微环境中产生的促炎性细胞因子促进肿瘤的进展和转移。肿瘤微环境由肿瘤细胞、多种基质细胞、细胞因子和趋化因子等构成。IL-6、TNFα是两种最重要的炎症细胞因子。研究发现,骨髓瘤患者血液及骨髓中含有异常升高的IL-6和TNFα,并与肿瘤的复发、进展及不良预后相关。在人恶性黑色素瘤细胞系WM-266-4中,IL-6能激活STAT3,使其磷酸化,导致Twist1表达上调,进而Twist的下游蛋白N-cadherin表达也增高。最终,肿瘤细胞具有更强的侵袭力,易发生转移。在乳腺癌中,TNFα依赖NF-κB介导的转录因子Twist1上调,诱发EMT,促进癌细胞的浸润和血管新生。目前,关于Twist1是否在骨髓瘤中表达及其意义,以及炎性细胞因子IL-6和TNFα是否影响Twist1的表达,相关研究尚未见报道。探讨Twist1是否参与骨髓瘤的发生、发展及其作用机制,对于骨髓瘤的预后评估及治疗具有重要意义。因此,本研究旨在探讨Twist1在骨髓瘤中的表达及其意义,研究论文分为三部分,第一部分:检测骨髓瘤患者骨髓及髓外病变组织中Twist1的表达及其预后意义。第二部分:在人骨髓瘤细胞系中过表达Twist1,观察其生物学行为的变化。第三部分:IL-6、TNFα对Twist1表达的影响。通过以上研究,探讨Twist1在骨髓瘤进展中的作用及可能机制,为骨髓瘤的靶向治疗提供理论依据。第一部分Twist1在多发性骨髓瘤合并骨的髓外病变患者中的表达及意义目的:通过检测多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)合并骨的髓外病变(extramedullary disease,EMD)患者骨髓组织和局部病变组织中EMT相关转录因子Twist1及ZEB1的表达情况,分析它们与临床各指标之间的关系,进而阐明EMT相关转录因子在MM合并骨EMD患者中的的临床意义。方法:1采取免疫组化的方法,检测Twist1和ZEB1在70例MM合并骨EMD患者的EMD组织、骨髓以及33例不合并EMD患者的骨髓组织瘤细胞中的表达情况,并结合临床病理资料进行统计学分析。2采用CD34标记血管内皮细胞的方法计数骨髓组织和EMD组织中的微血管密度。结果:1 Twist1在MM合并骨EMD患者的EMD组织中骨髓瘤细胞核上的阳性表达率为24.3%(17/70),显著高于其骨髓组织以及不合并EMD患者的骨髓组织,差别具有显著统计学差异(分别为P=0.030和P=0.011)。2 ZEB1的阳性表达率在MM不合并骨EMD组织患者的骨髓、合并骨EMD患者的骨髓以及骨EMD组织中分别为30.0%(9/30)、30.3%(10/33)和45.7%(32/70)。ZEB1的阳性表达率在骨EMD组织和二种骨髓中均无统计学差异(P=0.185和P=0.197)。3 Spearman相关分析显示,骨EMD组织中骨髓瘤细胞核Twist1和ZEB1的表达之间呈正相关(r=0.350,P=0.003)。Twist1高表达组微血管密度(microvessel density,MVD)显著高于Twist1低表达组(P=0.004)。然而,ZEB1高表达组和ZEB1低表达组之间MVD无统计学差异(P=0.623)。4 Twist1高表达组的无进展生存期(progression-free survival,PFS)显著低于Twist1低表达组(11.8%vs.35.0%,P=0.000),Twist1高表达组的总生存期(overall survival,OS)显著低于Twist1低表达组(52.5%vs.83.7%,P=0.001)。多因素分析显示,Twist1高表达是预测短PFS(HR=2.161;95%CI:1.116-4.183;P=0.022)和OS(HR=3.111;95%CI:1.114-8.685;P=0.030)的独立预后指标。单因素分析中ZEB1的高表达只与三年OS有关。综合以上实验结果:Twist1在MM合并骨EMD患者的EMD组织中阳性表达率显著高于其骨髓组织以及不合并EMD患者的骨髓组织。Twist1高表达是MM合并骨EMD患者的不良预后指标,且Twist1的表达可能与MM合并骨EMD的血管新生有关。第二部分Twist1过表达对骨髓瘤细胞生物学行为的影响目的:上一部分研究发现Twist1在骨髓瘤中的表达与患者预后不良相关。但Twist1在骨髓瘤发生、进展中具体机制尚不清楚。本研究通过慢病毒转染人骨髓瘤细胞,建立稳定过表达Twist1的肿瘤细胞株,全面观察肿瘤细胞生物学行为的变化,进而探讨Twist1在骨髓瘤进展中的作用。方法:1利用慢病毒转染骨髓瘤细胞RPMI8226、LP1,建立稳定过表达Twist1基因的细胞株。2采用Western Blot和Real-time PCR方法验证Twist1过表达效果。3 CCK-8法检测twist1过表达后骨髓瘤细胞增殖情况。4采用FCM技术分析Twist1过表达后骨髓瘤细胞凋亡变化。5 Transwell小室迁移实验观察肿瘤细胞Twist1过表达后迁移能力改变。6采用ELISA和Western Blot方法检测骨髓瘤细胞过表达Twist1后VEGF的分泌及表达情况。7采用Western Blot方法检测Twist1过表达后骨髓瘤细胞EMT相关基因蛋白Vimentin、E-cadherin、N-cadherin的表达变化。8 CCK-8法检测Twist1过表达后骨髓瘤细胞对硼替佐米敏感性的影响。结果:1慢病毒转染建立稳定过表达Twist1的人骨髓瘤细胞株含有表达Twist1的慢病毒颗粒及阴性对照慢病毒颗粒分别感染人骨髓瘤细胞系RPMI8226、LP1,嘌呤霉素药筛后,荧光倒置显微镜下观察,90%以上肿瘤细胞发出红色荧光,细胞生长状态良好。2转染效果鉴定q RT-PCR和western-blot检测发现慢病毒转染骨髓瘤细胞RPMI8226和LP1后,与空白对照及阴性对照组相比,Twist1基因在m RNA和蛋白水平上都明显上调(P<0.05)。3 Twist1过表达增强细胞的增殖能力用CCK8检测细胞增殖,两种细胞的Twist1过表达组细胞增殖能力与各自阴性对照组相比都明显增强(P<0.05)。4 Twist1过表达抑制肿瘤细胞凋亡流式细胞术发现,8226-Twist1组细胞总凋亡率(2.98±0.41)%与8226-NC组总凋亡率(7.14±0.47)%相比,细胞凋亡明显减少(P<0.01)。同样,与LP1-NC组总凋亡率(4.27±0.34)%相比,LP1-Twist1组(1.76±0.32)%细胞凋亡明显减少(P<0.01)。这说明Twist1过表达能抑制骨髓瘤细胞的凋亡。5 Twist1过表达可增强肿瘤细胞的迁移能力Transwell小室迁移实验通过计数各组穿膜细胞数发现,8226-NC组,8226-Twist1组穿膜细胞数分别为,58.00±6.56,102.33±12.58。LP1-NC组,LP1-Twist1组穿膜细胞数分别为67.00±5.00,125.33±9.61,无论8226还是LP1细胞,Twist1过表达组与各自阴性对照组比,穿膜细胞数均明显增加,细胞迁移能力明显增强(P<0.05)。6 Twist1过表达可增加肿瘤细胞VEGF的表达ELISA试剂盒测定细胞上清VEGF浓度,western-blot检测细胞VEGF蛋白表达。结果发现,与各自阴性对照组相比,Twist1过表达组骨髓瘤细胞VEGF的分泌明显增多,肿瘤细胞VEGF蛋白表达亦明显增强,差别均有统计学意义,P<0.05。7 Twist1过表达对EMT相关蛋白的影响Western-blot检测发现,与空白对照及阴性对照相比,骨髓瘤细胞Twist1过表达后上皮性标志物E-cadherin表达下降,间叶性标志物Vimentin、N-cadherin表达增强。提示Twist1过表达可引起EMT样作用。8 Twist1过表达后肿瘤细胞对硼替佐米的敏感性下降用CCK8检测硼替佐米对各组细胞的抑制率,求得IC50。当药物浓度为10n M时,硼替佐米对两种肿瘤细胞Twist1过表达组和阴性对照组的抑制率无明显差别,但当药物浓度达到20n M及以上时,硼替佐米对Twist1过表达组肿瘤细胞的抑制率比各自阴性对照组明显降低(P<0.05)。8226-NC组与8226-Twist1组的IC50分别为21.63±2.30 nmol/L vs28.63±8.52 nmol/L。LP1-NC组及LP1-Twist1组的IC50分别为25.59±4.07nmol/L vs 29.55±11.32nmol/L。与各自对照组相比,Twist1过表达组的IC50均明显增高。实验结果表明硼替佐米对Twist1过表达组肿瘤细胞的抑制率降低,Twist1过表达可减弱肿瘤细胞对硼替佐米的敏感性,产生化学抗性。综合以上结果,慢病毒转染骨髓瘤细胞过表达Twist1基因后,肿瘤细胞增殖能力增强,细胞凋亡减少,迁移能力增加,骨髓瘤细胞VEGF的表达增加,对化疗药物硼替佐米的敏感性降低。另一方面,Twist1过表达引起EMT相关基因蛋白E-cadherin的表达减少,Vimentin、N-cadherin表达增加,诱发EMT,促进肿瘤的进展、转移。Twist1基因是骨髓瘤细胞发生EMT样作用的关键调节因子。第三部分TNFα、IL-6对Twist1表达的影响目的:我们在第一部分研究发现,合并EMD的骨髓瘤患者高表达Twist1基因,并且与不良预后相关。第二部分体外研究骨髓瘤细胞过表达Twist1后,可通过提高细胞增殖、迁移、减少凋亡,促进血管新生、EMT样作用和降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等促进肿瘤的进展和转移。但骨髓瘤患者肿瘤细胞高表达Twist1从何而来,受什么因素调节,目前尚不清楚。既往研究发现骨髓瘤患者血清和骨髓液中TNFα、IL-6水平异常升高,并且与肿瘤的复发、进展及不良预后相关。为明确骨髓瘤肿瘤微环境中TNFα、IL-6和Twist1表达之间的关系,本部分实验通过TNFα、IL-6刺激骨髓瘤细胞RPMI8226,检测Twist1、EMT相关基因、NF-κBp65、p-NF-κBp65、STAT3、p-STAT3的表达变化,明确TNFα、IL-6对Twist1表达的影响及可能机制。方法:1采用Western Blot方法检测TNFα、IL-6刺激骨髓瘤细胞对twist1表达的影响取对数生长期细胞,以2×105个/ml的浓度接种于6孔板,分别以0、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml浓度的IL-6或TNFα处理细胞24h后提取蛋白,采用Western Blot方法检测Twist1的表达变化。2采用Western Blot方法检测TNFα、IL-6刺激骨髓瘤细胞对EMT相关蛋白、NF-κB p65、STAT3蛋白表达及磷酸化水平的影响。取对数生长期细胞,以2×105个/ml的浓度接种于6孔板,以40ng/ml浓度的IL-6或TNFα处理细胞24h后提取蛋白,采用Western Blot方法检测Twist1、E-cadherin、Viemntin、N-cadherin、核NF-ΚB p65、p-NF-ΚB p65、STAT3、p-STAT3表达变化。3采用Western Blot方法检测NF-ΚB抑制剂预处理后,TNFα刺激骨髓瘤细胞对Twist1表达的影响。取对数生长期细胞,100μM PTDC(NF-κB抑制剂)预处理2h,移去PTDC,更换新的1640培养基,再给予TNFα至终浓度40ng/ml,24 h后收集细胞,提取蛋白质,用Western blot检测Twist1的表达变化。4采用Western Blot方法检测STAT3抑制剂预处理后,IL-6刺激骨髓瘤细胞对twist1表达的影响。取对数生长期细胞,1μM Cpd188(SATAT3抑制剂)预处理1h,移去Cpd188,更换新的1640培养基,再给予IL-6至终浓度40ng/ml,24 h后收集细胞,提取蛋白质,用Western blot检测Twist1的表达变化。结果:1 TNFα、IL-6可提高骨髓瘤细胞Twist1蛋白的表达Western Blot检测发现,以不同浓度TNFα、IL-6刺激骨髓瘤细胞RPMI8226,都能增加Twist1的蛋白表达,并且随着IL-6、TNFα浓度的增加,Twist1蛋白表达逐步增强,有量效依赖关系。2 Twist1参与TNFα、IL-6引发的EMT样作用TNFα、IL-6刺激RPMI8226细胞后,间叶组织标志物Viemntin、Twist1、N-cadherin升高,而上皮细胞标志物E-cadherin则表达降低,提示TNFα、IL-6引发EMT样作用,促进骨髓瘤的进展,Twist1蛋白参与其中。3 TNFα通过激活NF-κB信号通路,上调Twist1的表达。TNFα刺激RPMI8226细胞,p-NF-κB p65、细胞核中NF-κB p65、Twist1蛋白表达均升高;先用NF-κB抑制剂PTDC预处理RPMI8226细胞,再加TNFα刺激,发现Twist1蛋白表达减少。提示TNFα可能是通过激活NF-κB信号通路,上调Twist1的表达。4 IL-6通过激活STAT3信号通路,上调Twist1的表达。IL-6刺激RPMI8226细胞,STAT3蛋白表达减少,P-STAT3、Twist1蛋白表达升高;先用p-STAT3抑制剂Cpd188预处理RPMI8226细胞,再加IL-6刺激,发现Twist1蛋白表达减少。提示IL-6可能是通过激活STAT3信号通路,上调Twist1的表达。综合以上结果,TNFα、IL-6刺激骨髓瘤细胞RPMI8226均能增加Twist1的表达。TNFα、IL-6分别通过NF-κB、STAT3信号通路,上调Twist1的表达,引发EMT,促进肿瘤的进展。结论:1 Twist1在MM合并骨EMD患者EMD组织中的阳性表达率显著高于其骨髓组织以及不合并EMD患者的骨髓组织。Twist1的表达与肿瘤组织MVD呈正相关。多因素分析发现,Twist1高表达是骨髓瘤合并EMD患者的独立预后指标。2骨髓瘤细胞过表达Twist1后,细胞增殖能力、迁移能力增强,凋亡减少,对硼替佐米的敏感性降低,引起骨髓瘤细胞VEGF的表达增加。另一方面,Twist1过表达引发EMT样作用,Twist1基因是骨髓瘤细胞发生EMT样作用的关键调节因子。为靶向下调Twist1,抑制骨髓瘤细胞的生长、转移及肿瘤耐药提供理论依据。3 TNFα、IL-6均能提高骨髓瘤细胞RPMI8226中Twist1蛋白的表达。4 TNFα、IL-6分别通过NF-κB、STAT3信号通路增加Twist1的表达,Twist1参与其引发的EMT样作用,促进骨髓瘤的进展。