研究背景 心血管疾病是慢性肾功能衰竭(CRF)患者主要的并发症之一，也是终末期肾病长期血透患者的主要致死原因。CRF患者心血管并发症的发生率比同龄正常人高10—20倍，且发病年龄提前，被称为“加速性血管病变”，其发病机制目前尚未阐明，但很可能与这类病人的代谢紊乱有关。以往的研究表明，CRF患者循环中晚期糖基化终产物(AGE)含量增高，在罹患动脉粥样硬化的CRF病人的动脉血管壁中发现有AGE沉积，大量的AGE蓄积可能参与了CRF病人血管并发症的发生，因此，AGE被认为是一种新的“毒素”。 AGE是蛋白质、脂类的氨基与糖的醛基之间非酶性糖化氧化反应的终产物，在血管壁堆积，可引起胶原纤维间过度交联，导致血管硬化、顺应性降低。AGE是通过与细胞表面的AGE受体(RAGE)相互作用而发挥其病理生理效应的，作用的细胞不同，其发挥生物学效应也有差异。AGE可以介导单核—巨噬细胞的趋化性，使单核细胞穿过内皮细胞游走能力增强，并刺激细胞因子如IL-1β、TNF—α的分泌，IL-1β、TNF—α通过上调内皮细胞粘附分子的表达进一步增加单核细胞浸润，使炎症反应放大，从而加速了动脉粥样硬化的形成。以往研究也发现，CRF患者单核细胞AGE受体的表达明显上调，这种过多表达的受体可能增强单核细胞对AGE刺激的反应，这可能是CRF患者体内IL-1β、TNF—α较正常人明显增高的原因。此外，体外实验也证实，TNF—α能够上调单核细胞AGE受体的表达，从而形成一种病理循环。这可能是CRF病人动脉粥样硬化发生率高于一般人群的原因。 AGE介导单核细胞分泌细胞因子IL一lp、TNF一a可能参与了CRF患者相关疾病的病理过程，但AGE是如何诱导IL一lp、TNF一a等炎症因子的产生，目前机制还不清楚。本研究旨在观察AGE与以GE相互作用诱导单核细胞产生细胞因子的作用，并对其细胞信号转导机制进行探讨。方法 我们选择健康成年人外周血中的单核细胞为靶细胞，采用如下方法观察了AGE修饰蛋白对单核细胞分泌细胞因子IL一lp、TNF一a的影响。 一单核细胞分离、处理 采用密度梯度离心法分离健康成人志愿者外周血单核细胞，在10%(v/v)胎牛血清的1640培养液于37oC、5%C 02孵箱 中培养，2小时后洗去未贴壁的细胞，将己贴壁的细胞消化收集，调整所需细胞浓度。二.单核细胞生成工L一lp、TNF一。能力测定 AGE一HSA与单核细胞共同作用后，用ELISA法测定上清液中IL一lp、TNF一。的含量，设未经AGE修饰的HSA为对照组。在阻断实验中，单核细胞分别与不同浓度的抗以GE IgG、apoeynin或SB 203580预处理1小时后，再与50 pg/mlAGE一HSA共同培养24小时，按上述方法测定工L一lp、TNF一。的生成。 三.单核细胞生成活性氧的检测 细胞处理方式同一、二。加入对02一特异的探针 7一dihydroimidazo[1，2一a〕pyrazine一3一one(MCLA)，用化学 发光法检测AGE一HSA诱导单核细胞02一的产生量。四.单核细胞NF一KB活性检测 (一)免疫细胞化学染色法 细胞接种于置有盖玻片的24孔板中，预处理方法同二， 在AGE一HSA作用下，免疫细胞化学染色后，观察细胞核内 NF一KB的激活移位情况，以及抗RAGE IgG、apoeynin 或SB 203580预处理细胞后NF一KB的核移位变化。 (二)凝胶迁移电泳(E MSA)法 将分离的单核细胞接种于培养瓶中，预处理细胞方法 同二，提取细胞核蛋白、电泳后观察AGE一HSA及抗RAGE IgG、apoeynin或SB 203580作用于细胞后，胞核NF一KB 的活化情况。五.统计学方法 所有结果均重复3次以上，数据以妥士sD表示。统计由 SPSS 10.0软件完成，采用One一ay ANOVA一SNK法比较总体 及组间差异。结果一AGE诱导下单核细胞产生细胞因子的和活性氧的受体途径 与未经刺激(单纯培养液培养)的对照组相比，AGE一HSA培养24小时后，单核细胞上清液中IL一lp和TNF一a的水平明显增加(P(0.01)，活性氧的生成也明显增加(P(0.01)。未经修饰的HSA对上述细胞因子和活性氧的生成无明显影响， 表明AGE一HSA的刺激作用源自AGE修饰而非HSA本身的作用。 抗RAGE IgG以剂量依赖的方式抑制AGE诱导细胞因子的释 放和活性氧的生成，而非免疫兔IgG无此作用，表明抗RAGE 抗血清的作用是特异性的。用1:100抗RAGE工gG封闭RAGE， 单核细胞在AGE一HSA刺激下生成工L一lp和TNF一a的作用分 别被抑制67%和70%，生成活性氧的作用被抑制70.9%。说 明AGE通过以GE介导的途径刺激单核细胞生成工L一lp、 TNF 一。和活性氧。二.AGE诱导下单核细胞活化的细胞内传导途径 AGE一HSA刺激使单核细胞NF一KB由胞浆向胞核移位，提示 NF一KB活化，EMSA分析进一步证实AGE一HSA诱导NF一KB活化， 用抗以GE IgG预处理细胞可明显抑制AGE一HSA诱导NF一KB活 化，提示，N卜KB活化是以GE的受体后细胞内信号途径。 用apocynin抑制NADPH氧化酶的活性能明显抑制 AGE一HsA诱导NF一KB活化，apocynin并以剂量依赖的方式抑 制AGE--HSA诱导IL一lp、TNF一。分泌和活性氧的生成，提示 NADPH氧化酶的激活可能是NF一KB活化的上?