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目的：探讨蓝光导致人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞胞内钙离子浓度变化;L-型钙通道亚基α1D基因表达的变化;RPE分泌VEGF,bFGF及PEDF的变化及其与L-型钙通道神经内分泌亚型(α1D)亚基蛋白表达变化之间的关系。以及二氢吡啶类化合物(Dihydropyfidines,DHPs)硝苯地平、(-)BayK8644是否可以干预。
方法：将第四代体外培养的人RPE细胞随机分为4组,A组:对照组;B组:光照组:C组:光照+硝苯地平组:D组:光照+(-)BayK8644组,用2000±5001ux蓝光照射体外培养的人RPE细胞6h,24h终止培养,酶联免疫法测定细胞分泌的血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialcellgrowthfactor,VEGF)碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF),色素上皮衍生因子(pigmentepithelium-derivedfactor,PEDF);蛋白免疫印迹(Westernblot)技术检测L-型钙通道α1D亚基的蛋白表达;逆转录聚合酶联反应(RT-RCR)与荧光定量PCR技术分析L-型钙通道神经内分泌亚基α1DmRNA的表达;用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度。
结果：(1)RPE细胞分泌功能变化:VEGF:光照组与光照+(-)BayK8644组高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000,O.ooo);光照+(-)BayK8644组VEGF浓度高于光照组(P=0.000);光照+硝苯地平组低于光照组和对照组,差异有统计学意义(P=0.000,0.001)。bFGF:光照组,光照+(-)BayK8644组高于对照组,差异有统计学意义(P=0.019,0.000);光照+硝苯地平组bFGF浓度低于光照组,差异有统计学意义(P=0.000);光照+(-)BayK8644组bFGF浓度高于光照组(P=0.006),光照+硝苯地平组与对照组比较bFGF差异无统计学意义(P=0.078)。PEDF:光照组、光照+硝苯地平组、光照+(-)BayK8644组与对照组比较,差异无统计学意义(P=0.318,0.411,0.860);光照+硝苯地平组、光照+(-)BayK8644组与光照组比较,差异无统计学意义(P=0.856,0.243);光照+(-)BayK8644组与光照+硝苯地平组比较,差异无统计学意义(P=0.321)。
(2)RPE细胞L-型钙通道α1D亚基蛋白表达的变化:光照组、光照+(-)BayK8644组α1D亚基/βactinIOD值均高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000,0.000);光照+(-)BayK8644组高于光照+硝苯地平组,差异有统计学意义(P=0.000)。聚丙烯酰胺凝胶显示光照组和光照+(-)BayK8644组α1D亚基蛋白表达高于对照组与光照+硝苯地平组。
(3)各组RPE细胞L-型钙通道α1D亚基蛋白表达量与RPE细胞分泌VEGF浓度存在正相关,相关函数为Y=0.7377X+0.4392,(Y为VEGF浓度,X为α1D亚基蛋白表达量),相关系数r有统计学意义。(r=0.674,F=8.333,P=0.016),各组RPE细胞L-型钙通道α1D亚基蛋白表达量与RPE细胞分泌bFGF浓度相关函数为Y=0.0739X+0.2466,(Y为bFGF浓度,X为α1D亚基蛋白表达量),相关系数r无统计学意义(r=0.537,F=4.061,P=0.072)。
(4)细胞内钙离子浓度变化:光照组、(-)BayK8644组、光照+(-)BayK8644组RPE胞内钙离子荧光强度高于无光照组,差异有统计学意义(P=0.000,0.000,0.000),硝苯地平组低于无光照组,差异有统计学意义(P=0.000),光照+硝苯地平组与无光照组相比较,硝苯地平组与光照+硝苯地平组比较,差异有统计学意义(P=0.000,0.000),(-)BayK8644组与光照+(-)BayK8644组比较,差异无统计学意义(P=0.155)。
(5)α1D亚基mRNA的表达:光照组、光照+(-)BayK8644组与光照+硝苯地平组α1D亚基mRNA均高于对照组,差异有统计学意义(P=0.023,0.006,0.010);光照+(-)BayK8644组高于光照组与光照+硝苯地平组,差异有统计学意义(P=0.032,0.039);光照+硝苯地平组与光照组比较无统计学意义(P=0.459)。
结论：(1)蓝光照射导致人RPE细胞L-型钙通道α1D亚基mRNA及蛋白表达量升高,VEGF,bFGF分泌量增加,α1D亚基蛋白表达与分泌VEGF量之间呈正相关;(2)钙通道抑制剂硝苯地平可以使人RPE细胞α1D亚基蛋白表达降低,VEGF,bFGF分泌减少,而该通道激动剂(-)BayK8644使人RPE细胞α1D亚基蛋白表达上调,VEGF,bFGF分泌增多。(3)钙离子浓度升高参与蓝光照射导致体外培养的人RPE细胞的损伤过程。