ZmAGO18b抗玉米小斑病的功能研究

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玉米小斑病是世界上普遍发生的重要病害之一,对玉米生产造成严重危害;然而,对玉米抗小斑病的分子机制的认识还很匮乏。sRNA介导的基因沉默(RNAi)是一种在真核生物中普遍存在的高度保守的调控基因表达机制,可以在转录水平和转录后水平调控基因的表达。目前已有大量研究表明,RNAi在调控植物抗生物胁迫过程中发挥重要作用;其中Argonaute(AGO)蛋白是RNAi途径中的核心蛋白,通过结合sRNA形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)行使功能。但是,RNAi途径调控玉米抗小斑病的分子机理还不清楚。本研究旨在研究ZmAGO蛋白在玉米响应小斑病菌胁迫过程中的作用,研究结果如下:1.利用关联群体材料的AGO家族基因及其基因上下游各50Kb的3031个SNP标记和2014年河南350份关联群体玉米小斑病表型数据进行候选基因关联分析,鉴定到ZmAGO18b基因与玉米抗小斑病表型显著相关。通过对关联群体中64份抗性材料和54份感病材料的ZmAGO18b基因进行重测序和候选基因关联分析,鉴定与表型性状相关联的3个SNP位点(-90A/G、185T/G、211A/-)。2.根据关联分析获得的与表型性状相关联的SNP位点信息构建HTH-17×CIMBL152 F2群体,对其进行抗玉米小斑病表型鉴定和ZmAGO18b基因型鉴定,统计学分析结果表明:ZmAGO18b的3个SNP(-90A/G、185T/G、211A/-)位点与抗病性显著相关。3.QPCR分析玉米ZmAGO18b在小斑病菌胁迫时的表达模式发现,在抗性材料中ZmAGO18b的表达受到抑制,在感病材料中ZmAGO18b被诱导表达。4.构建了ZmAGO18b超表达和CRISPR转基因材料,并筛选获得转基因阳性植株。利用ZmAGO18b超表达转基因植株接种小斑病菌进行表型鉴定和病菌积累量检测,结果均证实ZmAGO18b负向调控玉米对小斑病菌的抗病性。5.构建了YFP-ZmAGO18b的融合表达载体,在烟草中进行蛋白瞬时表达,利用共聚焦荧光显微镜观察ZmAGO18b定位在细胞核和细胞质中。6.利用酵母双杂交和荧光素酶互补试验筛选到3个ZmAGO18b的互作蛋白,其编码基因分别为ZmAGO18b-interacting protein1(18b IP1)、18b IP1-homolog(18b IP1H)和18b IP2。7.对18b IP1、18b IP1H和18b IP2这3个基因进行小斑病菌胁迫时的表达模式分析,发现18b IP1的表达被显著抑制,18b IPH被诱导表达,18b IP2的表达不受小斑病菌胁迫的影响。8.分别对18b IP1和18b IP1H进行同源性分析,构建超表达载体和CRISPR载体,进行遗传转化。
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