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研究背景慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一组以气流受限为特征的肺部疾病,呈进行性发展,是呼吸系统的常见病、多发病,40岁以上人群患病率为8.2% ,总体人群患病率为3%。世界银行/世界卫生组织公布,至2020年COPD将位居世界疾病经济负担的第5位。近年随着新型抗生素和以激素为主的抗炎药物的应用,COPD急性加重期症状能够得到有效的控制,缓解期的生活质量亦得以提高。但是,众多措施都难以达到阻止COPD发展进程的效果。随着对COPD的深入研究发现,COPD的发生是多因素共同参与的以呼吸道炎症为核心的病理过程,但其发病机制至今尚未完全阐明。IL-17是近年研究发现的一种细胞因子,主要由Th17和γδT细胞分泌。Thl7细胞和γδT细胞主要介导慢性炎症,在自身免疫性疾病、炎症性疾病及防御粘膜胞外菌感染中发挥重要作用。COPD亦属于多因素共同参与的呼吸道慢性炎症性疾病之一,那么,分泌IL-17的T细胞是否在COPD发生、发展过程中起到诱导炎症的作用?其作用机制和变化规律又是怎样的?目前尚不清楚。成功建立标准化的COPD动物模型不仅有利于深入了解COPD发病机制,同时也有利于发现新的治疗靶点。吸烟所致的有害气体和有害颗粒是导致COPD最常见的原因之一。本实验采用慢性纸烟烟熏的方法建立COPD小鼠模型,并探讨分泌IL-17的T细胞及其相关细胞因子在COPD发病中的作用,为COPD的临床治疗提供新的理论和实验依据。研究目的1.建立COPD小鼠模型,观察不同阶段小鼠支气管及肺组织病理学变化。2.观察IL-17及相关细胞因子在COPD不同时期的变化,探讨其变化的意义。3.观察分泌IL-17的T细胞在COPD不同时期的变化,探讨其在COPD发生、发展过程中的作用,并明确IL-17主要的细胞来源,为COPD的防治提供实验依据。研究方法1.将40只5周龄C57/BL6小鼠按照随即数字表法分为4组,分别为对照组、熏4周组、熏8周组和烟熏12周组,烟熏组每日定量吸入香烟烟雾。2.眼球取血后断颈处死动物,收集一侧支气管肺泡灌洗液(BALF),采用酶联免疫吸附法检测血清和BALF中IL-17、22和23含量。3.采用密度梯度离心法分离肺组织中Th17、γδT细胞,并采用流式细胞技术检测各种细胞比例。4.采用HE、V.G染色,观察支气管和肺组织病理变化。5.利用Leica彩色图象处理系统测量测定支气管内面积与气管外面积比值,采用细胞计数法计算BALF炎症细胞数。研究结果1.同正常对照组比较,烟熏组小鼠体重增长缓慢,且烟熏3周后有显著统计学差异(P<0.05)。2.烟熏组小鼠气管、支气管及肺组织有慢性支气管炎、阻塞性肺气肿的特征性病理改变,总体表现为纤毛上皮部分剥脱,支气管上皮和成纤维细胞增生变厚,粘液腺及杯状细胞增生,管腔内粘液聚集,气道壁和小血管周围肺泡区以巨噬细胞和淋巴细胞为主的炎细胞浸润,同正常对照组相比,烟熏组小鼠的肺组织白细胞明显增高(P<0.05),以中性粒细胞和淋巴细胞浸润为主;烟熏4周组小鼠纤毛上皮部分脱落,部分管腔内有粘液增多;HE染色提示,烟熏组气道管壁较对照组逐渐增厚,气道管壁内径与气管外径比值随烟熏时间延长逐渐减小,烟熏8周组从开始出现显著差异(p<0.05),肺组织肺泡壁破坏、融合,有肺气肿的表现。V.G染色提示,烟熏12周后,大小气道胶原纤维增多,支气管纤维化形成。5.同正常对照组比较,烟熏组小鼠BALF中IL-17含量平均值随烟熏时间的延长逐渐增高,且于烟熏后14天出现显著统计学差异(P<0.05),到12周达到最高值;同正常对照组比较,烟熏组小鼠BALF中IL-23含量随烟熏时间的延长逐渐增高,且升高早于IL-17,于烟熏后第7天出现显著统计学差异(P<0.05) ,到8周达到顶点,10周以后略有下降;同正常对照组比较,烟熏组小鼠BALF中IL-22含量于烟熏后第7天明显升高(P<0.05),而后随烟熏时间延出现先升高后降低,于第8周达最低水平。6.同正常对照组比较,烟熏组小鼠肺组织中Th17细胞随烟熏时间的延长而逐渐增高,于12周达顶点(P<0.05);同正常对照组比较,烟熏组小鼠肺组织中γδT细胞数随烟熏时间的延长先增高后降低,其中在第8周时表现为最高(P<0.05),12周时略有降低(P>0.05)。同正常对照组比较,烟熏组小鼠肺组织中分泌IL-17的γδT细胞数在烟熏早期即有增多,在第4周达最高(P<0.05);烟熏8周组结果较烟熏4周组略有降低(P>0.05),而烟熏12周组结果同烟熏8周组无明显差异(P>0.05)。结论1.采用半定量纸烟烟熏方法,成功建立C57/BL6小鼠COPD模型。2. IL-17参与C57/BL6小鼠COPD的发生、发展整个炎症过程,起到炎症诱导作用。IL-22在COPD的支气管炎症中起到促炎作用。IL-23在IL-17升高之前即有增高,说明IL-23/IL-17通路可能参与了小鼠COPD的炎症,提示IL-23/ IL-17通路可能是未来临床COPD炎症调节的重要靶点之一。3.小鼠COPD发生发展过程中,Th17表达量大量增高,在维持小鼠COPD的炎症中起主要作用,其中在COPD早期分泌IL-17的γδT细胞起到炎症的启动作用。