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随着各种淀粉酶的广泛应用和工农业社会对淀粉酶更加多样化的需求,催化能力强、稳定性高、耐受范围广、不依赖金属离子的新型优良淀粉酶成为了研究的一个热点。而获得新型的淀粉酶途径之一是寻找产生淀粉酶的新菌种,另一种方法就是在原有的基因资源基础上进行酶分子的改造,同时探索基因序列与酶分子结构功能的关系。对于这方面的研究在国内外早已开展,并取得了不少成果和经验。在酶分子改造方法中,除了对酶活中心及周围氨基酸进行突变的改造,和对酶蛋白结构域的研究,还有对酶分子的长度影响进行的探讨,尤其是对N端和C端氨基酸部分缺失和改变的研究。
本文通过PCR获得Thermomonosporacurvata菌株中一个α-淀粉酶基因,与表达载体pSE380构建重组子后转化入E.colixl-10中,IPTG诱导获得表达纯化并研究了其部分酶学性质。研究表明该酶最适温度为60℃,最适pH为8.0,对可溶性淀粉的Km值为1.33g/L,Vmax值为55.56g/L*min,HPLC检测其水解可溶性淀粉主要产物为17.45%葡萄糖,31.24%麦芽糖和51.30%麦芽三糖,2mM浓度下Ba2+和Mg2+对其有明显激活作用,Fe3+和Zn2+对其有抑制作用。对其N端分别截短10个和20个氨基酸序列,得到两个删减子基因,并以同样的方法得到表达,通过研究比较原始基因表达酶和删减子表达酶的部分酶学性质来探讨该淀粉酶基因N端部分序列对其结构和功能的影响。研究表明删减N端10个氨基酸后酶学性质变化不大,最适温度和最适pH均没有发生改变,对可溶性淀粉的Km值为2.07g/L,Vmax值为71.42g/L*min,其水解可溶性淀粉后产物为13.18%葡萄糖,43.66%麦芽糖,43.16%麦芽三糖,水解的能力有一定程度的提高。而删减20个氨基酸后,突变酶的最适温度和最适pH均发生了较大的改变,分别为80℃和5.5。水解可溶性淀粉产物为13.02%葡萄糖,41.57%麦芽糖,32.39%麦芽三糖和13.02%麦芽四糖,Km值和Vmax值分别为2.38g/L和76.92g/L*min。关于温度和稳定性的研究还表明其水解能力有所下降,但稳定性有较大程度的提高。金属离子对删减子Amy-d20没有很明显的影响。推测Amy-tc的N端前20个氨基酸可能对其pH和温度稳定性有较大影响。