中枢神经系统退行性疾病(neurodegenerative diseases, NDD)是一组严重影响人们生活质量和致残的慢性进行性中枢神经组织退行性变性疾病,随人口老龄化的不断进展患病率日益增高,本组疾病的发病机制尚未完全阐明,推测与细胞兴奋毒性、细胞凋亡、氧化应激等机制有关,因此目前相关预防和治疗此类疾病的药物均不能达到较理想的效果。它包括阿尔茨海默痫(alzheimer disease, AD),帕金森氏病(Parkinson disease, PD),亨廷顿病(Huntington’s disease,HD),肌萎缩侧索硬化病(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等疾病。其病理特点为具有特定功能的神经核团发生萎缩和神经元丢失。这种神经元的丢失通常伴有星形胶质细胞增生、神经胶质过多症以及特定的神经病理标记,如帕金森病的路易小体(lewy body)。临床上,对于这类疾病尚无有效控制病程进展的措施,患者最终将丧失生活能力甚至死亡。目前,随着社会的进步、老年人口的比例和数量不断增加,这类疾病已经成为影响我国人口健康水平和生活质量的重大社会间题。近二十年的研究发现沉默信息调控因子类(silent information regulator, Sirtuins)与此类疾病密切相关,它的激活和抑制可能参与NDD发生发展过程的调节,此发现给今后预防和治疗此类疾病指引了新的方向。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)被广泛认为是刺激大脑产生炎症的炎症原,它是细菌内毒素,是革兰氏阴性菌外膜上的成分,通过协调炎症调节者的产生来调节先天性免疫,可以刺激炎症因子和氧自由基的产生,继而促进神经系统退行性疾病的发生和进展。PC12细胞是大鼠嗜铬细胞瘤细胞,国际上广泛作为神经元模型研究神经系统疾病。细胞凋亡是程序性的细胞死亡方式,它是神经退行性疾病病理生理有关的主要的信号路径之一。目前的研究表明LPS诱导PC12细胞凋亡进程中,NF-KB、COX-2、Bax、BCL-2、Caspase-3、Hsp70等参与凋亡过程,但LPS促进PC12细胞凋亡的机制尚未完全阐明。PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤,常规条件下培养,该细胞株性质与嗜铬瘤细胞相似,可作为一种儿茶酚胺细胞,因此,PC12细胞同时具有神经分泌细胞和神经元的性质,己被广泛用于神经细胞死亡方式及神经毒理方面的研究,PC12细胞含有的酶类、膜受体及合成的递质等方面很接近于中脑多巴胺神经元,因此,我们选PC12细胞作为多巴胺神经元的细胞模型。虽然对PC12细胞的研究结果无法完全代替黑质多巴胺神经元,但可以间接地为基础研究或临床治疗提供新的思路。组蛋白去乙酰化酶类(Histone deacetylases,HDACs)根据它们与酵母菌转录抑制物的同源性被划分为三类(Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类)。Ⅰ类和Ⅱ类的催化核心是明显类似的,与酵母菌去乙酰化酶Rpd3p和Hda1p同源。而HDACsⅢ与Ⅰ类和Ⅱ类没有序列相似性,它和酵母菌转录抑制剂——沉默信息调节因子(Silent information regulator2,Sir2)同源,我们把这类沉默信息调节因子称为Sirtuins。 Sirtuins广泛存在于原核生物和真核生物中。这类蛋白家族有高度的序列相似性,它们根据系统进化分析法被划分为五类(Ⅰ-Ⅳ和Ⅴ)。人类基因编码七个Sirtuins (Sirt1-Sirt7),类别上跨越Ⅰ-Ⅳ类。Sirtuins是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶Ⅲ (Histone deacetylases,HDACⅢ)它们是NAD+依赖的,通过去乙酰化的催化活性发挥作用。哺乳动物Sir2基因家族(Sirtuins)包括7个成员SIRT1-7。7个Sirtuins蛋白定居在不同的亚细胞位置发挥不同的功能。SIRT1是一种重要的核蛋白,它可以使H4K16和大量的非组蛋白靶点例如P53, Ku70, PPARγ, PGC-1α, NF-κ B, HIF-2α, XPA和若干FOXO亚型去乙酰化。因此SIRT1是被包括在多种多样重要的细胞进程中,包括增殖,DNA修复机制和凋亡,并且被认为在癌症和葡萄糖的体内平衡中也发挥重要的作用。此外,上调SIRT1可能调节能量限制对生命进程的影响在低等生物的研究上。SIRT2定位在细胞质作为一种微管去乙酰化酶但是它也存在于细胞核内并且和组蛋白相互作用。尽管SIRT2作为一种潜在的肿瘤抑制剂,最近的研究表明同时抑制SIRT1和SIRT2对P53介导的癌细胞凋亡方面是必不可少的。SIRT3、SIRT4、SIRT5是线粒体蛋白,它们和大量的调节细胞代谢的进程相关。例如SIRT3使线粒体合酶、乙酰辅酶a合酶2和谷氨酸盐去乙酰化使其激活,谷氨酸盐通过柠檬酸途径产生ATP。SIRT4,至今鉴定的没有去乙酰化酶活性的物质,它对抗SIRT3对谷氨酸ADP核糖基化的影响。SIRT4基因敲除的大鼠在葡萄糖刺激时显著提高胰岛素的水平,而过表达SIRT4的大鼠胰岛素分泌则显著减少。最近发现在肝和肌肉细胞依赖SIRT4(?)脂肪酸氧化方面也支持抑制SIRT4可能对治疗糖尿病有利。通过使氨甲酰磷酸合成酶1去乙酰化SIRT5控制尿素循环最初的步骤并且出去毒性氨。SIRT6是一种核蛋白,它使调节末端着丝粒的染色质的H3K9去乙酰化。敲除SIRT6导致染色质缺乏进而导致过早老化的症状和甘油三酯合成增多和脂肪肝形成等代谢紊乱。SIRT6也通过调节DNA修复机制有助于基因组的稳定。SIRT7和核内RNA聚合酶I相关所以被认为是参与转录,它还与细胞活力相关。SIRT7可能通过确保组织稳态阻止心脏老化。目前Sirtuins与神经系统退行性疾病的关系正日益受到人们的关注。Sirtuins的激活剂包括白藜芦醇(resveratrol, Res)、漆树黄酮(fistein)、紫铆因(butein)等,主要通过激活组蛋白去乙酰化酶的活性来延长细胞的寿命。Sirtuins的抑制剂包括烟酰胺、sirtinol、splitomicin等。白藜芦醇的存在形式有4种：顺式白藜芦醇、反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇苷和反式白黎芦醇苷。后两种形式在肠道中可被糖苷酶分解释放出白藜芦醇,发挥其药理作用。其中,反式异构体生理活性强于顺式异构体,单体的活性大于糖苷。在紫外光照射下反式白藜芦醇能够转化为顺式异构体。白藜芦醇广泛存在于种子植物中,目前至少在12科31属72种植物中被发现。富含白藜芦醇的植物主要有葡萄、花生及中药虎杖等,尤其在新鲜的葡萄皮中含量最高,并以反式占主导地位。流行病学调查发现,法国人的冠心病等心血管疾病的发病率和死亡率要远远低于英美等国,即“法国怪圈”(Franch poradox)，其原因可能是饮用适量的红葡萄酒作用。进一步研究发现其中起主要作用的是红葡萄酒中所含成分白藜芦醇作用的结果。Res通过N端和SIRT1相连,提高它的活性来发挥作用。因为RES与细胞寿命和存活的相关性,所以RES为“长生不老”药物受到广泛关注。本文研究RES在神经元细胞凋亡时发挥的作用,为以上假说提供相关证据。为了观察SIRT1是否参与LPS诱导的PC12细胞的凋亡过程及其RES在这一过程中发挥的作用,本文将进行以下两部分实验。第一部分：SIRT1在脂多糖诱导的PC12细胞凋亡中的作用研究目的：探讨SIRT1在脂多糖诱导的PC12细胞凋亡中的作用。研究方法：第一组实验(确定LPS的损伤浓度进行下一步实验)①正常组：PC12细胞正常培养,加入生理盐水；②实验组：PC12细胞分别与200μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、1250μg/ml浓度LPS作用24h。MTT法检测PC12细胞的存活率。第二组实验(观察SIRT1和细胞凋亡的关系)①正常组：PC12细胞正常培养,加入生理盐水；②实验组：PC12细胞分别与浓度为1000μg/ml的LPS作用1/2h、2h、18h、24h、48h。Hoechst染色、流式细胞技术观察不同时间点细胞凋亡情况；Western blotting技术定量不用时间点SIRT1的表达。研究结果：1、MTT结果显示不同浓度LPS刺激PC12细胞都可导致细胞存活率下降,200μg/ml与250μg/ml浓度对存活率的影响没有统计学意义(P>0.05)。然后随着浓度增加细胞存活率逐渐下降,1000μg/ml时存活率(0.6267±0.02)%,1250μg/ml时达到最低(0.4533±0.05)%。根据以上结果本实验选择1000μg/ml浓度进行后续试验。2、Hoechst染色结果提示自1/2h开始观察到PC12细胞出现凋亡,表现为核固缩、核碎裂,18h开始凋亡小体增多,24h达到高峰,48小时后又有所下降；3、流式细胞仪测量结果显示各实验组PC12细胞凋亡率与对照组相比均有统计学意义(P<0.05),随时间延长凋亡率逐渐增加,24h时达到高峰,48h后又有所下降,这与Hoechst染色法观察到的PC12细胞凋亡结果相吻合；4、Western blotting法定量测量各时间点SIRT1的表达情况,对照组表达量(1.84±0.04),.自1/2h开始SIRT1蛋白表达有所减低(1.17±0.09),24h时表达最低(0.62±0.03),48h组表达量有所回升(0.77±0.02),各组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；结论：本部分实验中观察到LPS可以诱导PC12细胞凋亡,抑制SIRT1的表达,细胞凋亡程度与SIRT1的表达量相关,1000μg/ml浓度的LPS作用24h凋亡率最高,SIRT1在此时表达最低。第二部分：白藜芦醇在脂多糖诱导的PC12细胞凋亡中的作用研究目的：白藜芦醇在脂多糖诱导的PC12细胞凋亡中的作用。研究方法：实验分为6组,第1组加入生理盐水,2组LPS浓度为1mg/ml,3组LPS浓度为1mg/ml,RES浓度为5μ M,4组LPS浓度为1mg/ml,RES浓度为10μM,5组LPS浓度为1mg/ml, RES农度为5μ M,6组加入DMSO浓度与3、4、5组溶解Res所需DMSO浓度相同。1、流式细胞技术观察6组细胞凋亡情况；2、Western botting技术定量SIRT1的表达；研究结果：1、流式细胞仪检测结果为2与3组比较无统计学意义,1与6组比较无统计学意义,其余各组相比均有统计学意义。2、Western blotting法定量测量各时间点SIRT1的表达情况,2与3差别无统计学意义,1与6差别无统计学意义,其余各组均有统计学意义。结论：RES(浓度为5μ M)在LPS诱导的PC12细胞凋亡中无保护作用,浓度为(10μ M,25μ M)时有保护作用,随浓度增加保护作用增强。