论文部分内容阅读
目的:探讨常用微生态调节剂益生元——水苏糖及联用水果酵素（苹果、桑葚）对洛哌丁胺诱导SD大鼠便秘模型及其肠道菌群的调节作用与机制。方法:选取6周龄、雄性、SPF级SD大鼠48只,随机分为6组（每组8只）,分别为正常组（N组）、模型组（M组）、阳性对照组（AT组）、水苏糖干预组（ST组）、水苏糖苹果酵素混合干预组（SAT组）、水苏糖桑葚酵素混合干预组（SMT组）)。正常组（N组）实验全程灌胃0.9%生理盐水。其余5组SD大鼠连续8天每日每只动物给予1次洛哌丁胺20mg/（kg.d）灌胃给药,从粪便含水量和首粒黑便时间进行模型效果评价。造模完成后再进行连续8天干预,在干预过程中N组、M组采用生理盐水灌胃。AT组用生药浓度5.0×10-2g/ml的番泻叶浸剂进行灌胃治疗。ST组使用人体使用水苏糖剂量即3.0g/d/人（50kg体重）,换算至大鼠体重中使用浓度为12mg/ml的水苏糖生理盐水溶液进行灌胃。SAT组、SMT组酵素组分由水果酵素原液与生理盐水3:1配置,混合水苏糖浓度为12mg/ml进行灌胃。干预结束后测定大鼠肠运动比率（%）。取肠组织处理后进行HE染色和免疫组化处理,观察分析干预对SD大鼠洛哌丁胺便秘模型肠道组织结构的影响。16S rDNA PCR-DGG（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,变性梯度凝胶电泳）分析SD大鼠干预前后肠道菌群的差异性。使用实时荧光定量聚合酶链反应（q PCR）检测SD大鼠肠道菌群中双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、拟杆菌属（Bacteroidetes）、厚壁菌属（Firmicutes）菌群相对含量。使用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-q PCR）检测SD大鼠结肠上皮AQP3、AQP8相对表达含量。结果:干预前后N组测定数据几乎无改变,干预后AT组、SAT组、ST组、SMT组首粒黑便时间较模型组明显降低具有统计学意义（P<0.05）。干预后AT组、SAT组粪便含水量相对模型组升高但不具有统计学意义,ST组、SMT组粪便含水量较模型组明显升高具有统计学意义（P<0.05）。干预后组AT组、SAT组、ST组、SMT组肠推动比率较模型组明显升高具有统计学意义（P<0.05）。AT组、SAT组、ST组、SMT组大鼠结肠表现较模型组有明显改善。组织学上,干预后大鼠结肠黏膜上皮趋于恢复,腺体排列规则清晰,黏膜层恢复充盈膨胀,SAT组、ST组、SMT组大鼠结肠肌层以及黏膜下层较M组有明显增厚。免疫组化法检测结肠上皮AQP3、AQP8蛋白表达,SAT组、SMT组、ST组AQP3免疫组化评分高于M组,但组间无统计学差异。M组、ST组结肠AQP8免疫组化评分明显高于AT组（P<0.05）。16S rDNA PCR-DGGE分析SD大鼠造模后肠道菌群N组与其余造模组之间菌群有差异,干预后水苏糖联用水果酵素促使大鼠便秘模型肠道菌群趋向于与N组接近,其中AT组、SAT组N组趋近程度相较于ST组、SMT组更近。16S rDNA PCR-DGGE优势差异条带切胶测序分析结果,N组中具有条带位置和亮度差异的1、2号条带,结果显示条带1可能为Lactobacillus gasseri ATCC 33323=JCM 1131,同源性为98.15%,条带2可能为Lactobacillus agilis strain La3,同源性为88.75%。M组中具有条带位置和亮度差异的3、4、5、6、9号条带,结果显示条带3可能为Anoxybacillusamylolyticus strain DSM 15939 chromosome,同源性为94.12%,条带4可能为Lactobacillus animalis KCTC 3501=DSM 20602 NODE＿24,同源性为97.40%,条带5可能为Paraclostridiumbifermentans ATCC 638 gcd ATCC638.contig.17,同源性为97.08%,条带6可能为Thermincolaferriacetica strain Z-0001 Tfer＿ctg45,同源性为82.22%,条带9可能为Bacillus oryziterrae strain ZYK contig6,同源性为80.12%。SAT组中具有条带位置和亮度差异的10号条带,结果显示条带可能为Pectinophilus ATCC 43243 Scfld＿02＿1,同源性为97.01%。SMT组中具有条带位置和亮度差异的7、8号条带,结果显示条带7可能为Hungatellahathewayi WAL-18680supercont1.6,同源性为84.89%,条带8可能为Anaerostipescaccae DSM 14662Scfld＿03＿6,同源性为89.86%。经q PCR检测肠道菌群,双歧杆菌属（Bifidobacterium）相对于M组,N组、SAT组、ST组明显增高（P<0.05）。乳酸杆菌属（Lactobacillus）相对于M组,N组、SMT组明显增高（P<0.05）。拟杆菌属（Bacteroidetes）相对于M组,N组、SAT组、ST组明显增高（P<0.05）。肠道菌群拟杆菌属（Bacteroidetes）/厚壁菌属（Firmicutes）比例相对于M组,SAT组、ST组拟杆菌属（Bacteroidetes）/厚壁菌属（Firmicutes）比例明显升高（P<0.05）而N组、SMT组拟杆菌属（Bacteroidetes）/厚壁菌属（Firmicutes）比例明显降低（P<0.05）。经q RT-PCR检测结肠组织AQP3、AQP8表达水平,N组、SMT组、ST组AQP8蛋白表达水平明显低于M组（P<0.05）。结论:洛哌丁胺20mg/（kg.d）连续8天灌胃给药,可以造成SD大鼠便秘模型,在8天的干预过程中,SD大鼠便秘模型可以维持,不能完全恢复到正常状态。便秘会造成SD大鼠肠道菌群双歧杆菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属相对含量明显下降,肠道菌群拟杆菌属相对含量/厚壁菌属相对含量较正常组明显上升。使用水苏糖人体剂量时,水苏糖联用苹果酵素或桑葚酵素均可以改善SD大鼠便秘模型的便秘症状。其中,桑葚酵素联用水苏糖不仅对SD大鼠便秘模症状有更好的改善效果,同时还可以明显增加肠道菌群乳酸杆菌属含量、改善肠道菌群并明显降低结肠上皮组织AQP8蛋白表达水平。