【摘 要】
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血栓是心血管中局部血液发生凝固或者血液中某些有形的成分凝集而形成的固体小块,是导致心血管疾病发病和死亡的首要原因,其引起的血栓性疾病严重威胁人类生命健康,发病率和死亡率高居各种疾病之首。肝素是由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸等交替组成的一种酸性粘多糖,是目前防治血栓性疾病的重要药物之一。传统肝素主要提取于家畜小肠粘膜及肺组织,但存在宗教禁忌、残存病毒安全风险高以及出血副
【基金项目】
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国家重点研发计划课题（2019YFD0902005）； 广东省重点领域研发计划（2020B1111030004）；
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血栓是心血管中局部血液发生凝固或者血液中某些有形的成分凝集而形成的固体小块,是导致心血管疾病发病和死亡的首要原因,其引起的血栓性疾病严重威胁人类生命健康,发病率和死亡率高居各种疾病之首。肝素是由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸等交替组成的一种酸性粘多糖,是目前防治血栓性疾病的重要药物之一。传统肝素主要提取于家畜小肠粘膜及肺组织,但存在宗教禁忌、残存病毒安全风险高以及出血副作用大等问题。海洋贝类来源、结构及作用效果与肝素类似的类肝素,因其结构独特,来源相对清洁,抗血栓活性作用途径多样、出血副作用较小等特点受到越来越多的关注。本课题组前期研究发现从海蚌（Coelomactra antiquate）分离提取的类肝素组分（G）具有良好的纤溶活性和强抗凝活性,显示出较强的抗血栓潜力,但其分子量较大,存在黏度大、加工性能差和生物利用度低等缺点,阻碍了对其进一步的应用开发。因此,本课题以海蚌来源类肝素组分G为原料,采用过氧化氢降解法制备获得中、低分子量的类肝素,分析其理化性质及结构特征变化,同时采用体外及动物实验对降解前后海蚌类肝素组分的抗血栓活性进行评价,筛选出活性较高的组分,进一步制备海蚌类肝素纳米粒并评价其口服抗血栓活性,以期为海洋贝类来源类肝素的开发利用以及抗血栓化合物筛选提供一定的参考。主要研究内容及结果如下:（1）不同分子量海蚌类肝素的制备、理化性质及结构分析以新鲜海蚌肉为原料通过酶解、纯化制备类肝素G,采用H2O2-Vc降解法降解G以制备中、低分子量海蚌类肝素DG1和DG2,对G、DG1及DG2的理化性质及结构特征进行分析。结果显示,G、DG1和DG2热稳定性良好,重均分子量分别为60.25 k Da、24.48 k Da、6.75 k Da。降解并没有破坏海蚌类肝素的基本结构及活性基团,但改变了海蚌肝素的高级结构,随着降解程度的提高,海蚌肝素分子越趋于分散,越易被利用。（2）不同分子量海蚌类肝素抗凝、纤溶活性及出血副作用评价通过羊血浆法、发色底物法、天青A法、凝血三项APTT、TT、PT实验探究不同分子量海蚌类肝素的抗凝活性,采用琼脂糖纤维平板法、血块溶解实验评价纤溶、溶栓活性,并以小鼠尾部出血模型评价出血副作用。结果显示,不同分子量海蚌类肝素均具有抗血栓潜力,且出血风险低。G的抗凝效价及抗凝时间延长率均接近肝素标准品的70%。DG1的抗Xa/IIa值（2.13）接近于低分子量肝素标准品的抗Xa/IIa值（2.62）。DG2纤溶活性及溶栓活性强于G和DG1,其纤溶效价为10.690 U/mg,是尿激酶标准品的1/5,最大溶栓率达44.06%。G、DG1及DG2的出血时间延长率均不及商品肝素的8.02%。因此,本研究进一步比较不同分子量海蚌类肝素的体内抗血栓活性。（3）不同分子量海蚌类肝素抗血栓活性评价通过建立角叉菜胶诱导的小鼠黑尾模型评价不同分子量海蚌类肝素的抗血栓活性;通过测定小鼠体内凝血、血小板聚集、纤溶相关血液因子水平、测序肠道菌群基因,以初步探究不同分子量海蚌类肝素的抗血栓机制。结果显示:仅G2、DG1能显著地降低小鼠黑尾比率。在20 mg/kg剂量下,与模型组相比,肝素钠组、G组及DG1组黑尾比率分别降低了44.2%、32.7%、24.0%。但在40mg/kg剂量下,降低黑尾比率能力DG1＞G＞DG2（P＜0.05）。G2、DG1均可通过提高血栓小鼠血浆t-PA、FDP、DD水平,降低血浆v WF、TXB2水平,调节肠道菌群结构,以抵抗血栓的形成。因此考虑到DG1的分子量较小有利于口服,选取DG1制备海蚌类肝素纳米粒。（4）海蚌类肝素纳米粒的制备、表征及抗血栓活性研究以DG1为主料,选择具有抗血栓功能的姜黄素复合配比,通过单因素实验以优化海蚌类肝素纳米粒DG1-NPs及DG1/Cur-NPs的配方,并采用红外光谱、扫描电镜、差示热量扫描法表征纳米粒,建立肺栓塞小鼠模型评价其抗血栓的作用。结果显示,最佳配方为海藻酸钠6 mg/m L、氯化钙0.33 mg/m L、壳聚糖0.6 mg/m L、DG1 7.2 mg/m L、姜黄素0.24 mg/m L。按此配方得到了粒径小、电位绝对值接近于30 m V、载料量较高的纳米粒。DG1-NPs粒径为210.2 nm、Zeta电位为-33.3 m V、载DG1量为13.90 IU/mg;DG1/Cur-NPs的粒径为339.7 nm、Zeta电位为-28.4 m V、载DG1量为13.40 IU/mg、载姜黄素量为0.30%。在小鼠急性肺栓塞模型中,DG1-NPs抗血栓活性强于DG1,而DG1/Cur-NPs的抗血栓活性与DG1-NPs相当。
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