研究背景 近年研究表明，女性在绝经后，由于卵巢功能衰退，内源性雌激素分泌减少，骨与软骨组织中局部生长因子的表达发生改变，使骨形成和骨吸收平衡失调，软骨细胞失去维持表型的生长因子的支持，造成骨质丢失和软骨退变。业已证实，研究血小板衍生生长因子(PDGF)能够在体外和体内刺激成骨细胞的分裂、增殖，加速骨折愈合；体外培养的软骨细胞在PDGF的作用下，保持软骨细胞的表型，在支架材料上形成软骨组织。作者既往研究发现，PDGF对破骨细胞功能的影响受到成骨细胞调节，能够使成骨细胞—破骨细胞共育体系倾向骨形成发展。既然PDGF能够促进骨质生成，维持软骨细胞的表型，那么，对于雌激素缺乏所造成的骨质丢失以及软骨退变，PDGF是否具有逆转作用，是值得探讨的课题。 研究目的 PDGF在体外对成骨细胞—破骨细胞体系的作用机理，探讨PDGF对发生骨质疏松的去势大鼠骨与关节的生物学作用及机制，为临床应用PDGF治疗和预防骨质疏松以及关节退变提供实验依据。 材料与方法 1．在高浓度PDGF-AA的作用下，应用生化检查和图象分析技术，检测PDGF-AA对成骨细胞-破骨细胞共育体系中破骨细胞骨吸收功能的影响；应用免疫荧光检测破骨细胞合成抗酒石酸酸性磷酸酶的变化；应用免疫组化和RT-PCR技术检测骨保护素配体(OPGL)的表达。 2．应用化学比色法检测PDGF-BB对成骨细胞分泌一氧化氮产物的影响；通过RT-PCR技术观察PDGF-BB对成骨细胞表达内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)以及骨保护素mRNA的影响；应用免疫荧光和共聚焦显微镜技术观察成骨细胞分泌的NO对破骨细胞标志物—Vitronecting受体的影响。 3．通过H-E染色和免疫组化技术分析处理组和对照组组织学的改 变；应用1型胶原原位杂交技术观察PDGF－AA对1型胶原表达的影响； 通过生化方法检测血清骨代谢标志物一骨型碱性磷酸酶、骨钙素以及抗 酒石酸酸性磷酸酶的改变；应用RT—PCR分析PDGFAA对骨钙素、 PDGF—A mRNA表达的影响；通过骨密度仪检测各组骨密度的变化； 4．通过HE染色和免疫组化技术分析处理组和对照组组织学的改 变；应用1型胶原原位杂交技术观察PDGF－BB对1型胶原表达的影响； 通过生化方法检测血清骨型碱性磷酸酶、骨钙素以及抗酒石酸酸性磷酸 酶的改变；应用RT—PCR分析PDGFBB对骨钙素mRNA表达的影响。 通过免疫组化技术分析 eNOS和 iNOS在骨组织的表达规律；通过骨密 度仪检测各组骨密度的变化；检测一氧化氮合酶抑制剂（LNAME）对 上述指标的影响。 5．通过H－E染色和图象分析技术检测PDGF（AA、BB）对退变关 节软骨组织学改变的影响；应用BrdU掺入DNA、免疫组化法检测软骨 细胞增殖状况；采用 Na拓SO。掺入法测定硫酸软骨素类蛋白多糖合成率； 采用免疫组化染色方法分别检测TRAP、金属蛋白酶一9（MMPg）、PDGF （AA和 BB）在软骨的表达。 6．所有研究结果均运用 SPSS刀③进行拉丁方设计的方差分析。 结果 1．无论PDGFAA浓度如何变化，均不能直接使破骨细胞产生 TRAP的活性升高，不能直接促进破骨细胞的骨吸收功能；但在共育体 系中，高浓度PDGF－AA使H者都增强。OPGL mRNA的表达在高浓度 PDGFAA（60ng／ml禾 80ng／ml）的刺激下显著增加，但 OPG mRNA的 表达无明显改变。 2．培养上清液NO产物浓度随着PDGFBB的增高而上升，成骨细 胞对 eNOS、iNOS表达亦明显增加；PDGFBB不能直接促进成骨细胞 表达OPG，但在共育体系中，OPG的表达却有所增加；PDGFBB使破 骨细胞膜的Vitronectin受体表达增加，但共育体系的培养上清液可使破 骨细胞收缩，与骨片脱离。 3．PDGF－AA能够使去势大鼠骨组织生成，使1型胶原的合成与分泌 一3一增加；使成骨细胞表达骨钙素增强，升高血清骨型碱性磷酸酶的活性 （P＜0刀1）和显著降低血清＊RA P的活性（P仍刀1）：P＊G卜＊A能够上调＊＊＊卜Am RNRNA在骨组织的表达，使大鼠骨密度显著升高（P＜0刀1）。 4．PDGF七B使eNOS和iNOS在去势大鼠的骨组织中强烈表达，但受到一氧化氮合酶抑制剂的抑制；能够使去势大鼠骨组织生成，使1型胶原的合成与分泌增加；使成骨细胞表达骨钙素增强，升高血清骨型碱性磷酸酶的活性（P＜0刀1）和显著降低血清＊RA P的活性（P＜0刀1）；PDGFEB能够上调 PDGF丑 m洲A在骨组织的表达，使大鼠骨密度显著升高叩叼＊），而上述变化均被一氧化氮合酶抑制剂逆转。 5．去势大鼠关节软骨发生退变，P