前言血管重构（vascular remodeling）是指血管内皮损伤所引起的血管中膜平滑肌细胞（PASMCs）向内膜下的迁移与增殖，细胞外基质异常积聚，进而导致内膜、中膜增厚，血管腔狭窄，由此造成的血管壁疾病，PASMC异常增殖与凋亡是该类疾病的共有病变。肺动脉高压（pulmonary arteryhypertension,PAH）病因相当复杂，但有二条最终路径是必须的：1、肺血管收缩性增强。2、肺血管构型重塑。其具体表现为各种致病因素造成肺血管内皮细胞功能不全，使一些调节血管平滑肌舒缩与增生的体液因子的代谢、释放、生成、转运和分泌过程处于紊乱状态，同时，一些转录因子活性改变，使得一些调控平滑肌细胞凋亡、增殖的信号调控、信号转导的蛋白表达发生改变。肺动脉的管壁由内膜、中膜（非肌性动脉无中膜）和外膜构成。内膜是由一层连续的、扁平形的内皮细胞及基底膜以及内皮下腔构成的；血管中膜主要是由平滑肌细胞构成的，血管平滑肌细胞（VASMC）能对不同的生长因子进行反应，是最具有可塑性的细胞之一。血管平滑肌细胞可以增殖（伴随细胞数量增加的增生）、肥大（细胞体积增加、DNA含量不变）、核内再复制（DNA含量增加、细胞体积不变）和凋亡。各种刺激因素通过自分泌和旁分泌生长途径介导血管平滑肌细胞的上述各种反应。血管平滑肌细胞具有可塑性是指对血流动力学、发育和损伤刺激进行反应的关键机制（自／旁分泌生长机制）的反馈，使血管平滑肌细胞适应血管的重要生物学功能：例如生理上的血管发育、血管对组织损伤的反应和血管对组织需要所发生的重塑；病理上的动脉硬化、高血压、血管成型术后再狭窄和血管炎。显然，在各种情况下，血管壁中的内皮细胞与血管平滑肌细胞以及血管平滑肌细胞与其它细胞（成纤维细胞、树状细胞、炎细胞）之间的相互作用决定生长反应的性质。许多基因转录和生长因子相关的事件参与血管平滑肌细胞创建中膜的过程，这些过程在成年动脉和血管生成中可以再现。在成体血管，平滑肌细胞的生长出现于血管损伤之后。血管修复和内膜增生的过程在不同物种和不同动脉是类似的。目前，终止血管平滑肌细胞生长及调节血管平滑肌细胞数量的机制尚不清楚，虽然对血管平滑肌细胞凋亡机制的研究已取得很大进展，但有关血管大小及中膜厚度的调节机制尚待研究，但可以肯定的是自／旁分泌生长机制对新生内膜形成是必要的。内毒素肺损伤是临床常见的疾病，它是因感染而引起的全身炎症综合征（SIRS），其最终结局是多器官功能障碍（MOSD）甚至多器官功能衰竭（MOSF），其中肺脏是首发器官，由于病情复杂，难以控制，死亡率非常高，是目前难治病之一，也是目前研究的热点。内毒素是革兰氏阴性菌胞壁中的脂多糖（LPS）成分，TNF-α是介导LPS致急性肺损伤（ALI）的重要致病因素。我们前期动物实验也表明，LPS导致ALI时，肺血管内皮细胞首先受到攻击，发生坏死脱落屏障作用消失，引起PASMC继发性增殖、迁移，同时还出现血液动力学明显恶化如肺动脉压升高、平均动脉压下降、气道压升高、动脉血氧分压明显下降、肺水含量明显升高等症状，而且随着病情的发展会逐渐加重，最终导致难以控制的肺动脉高压和呼吸、循环功能衰竭，呼吸、循环功能衰竭又会造成其他器官供血、供氧不足进一步诱发全身多器官功能障碍，最终导致MOSF。为此，许多国内外学者致力于由肺血管构型重建引起的肺动脉高压防治研究，初步明确了肺血管构型重建过程中信号转导的分子及遗传学的机制。总体上的分子学机制大致有以下几种：1)BMP／TGF-β信号转导途径：包括Smad依赖性信号转导途径及非Smad依赖性途径。2)五羟色胺信号转导途径。3)细胞外基质途径。4)离子通道途径5)炎性因子途径。这些途径有时相互作用、交叉共同发挥它们的调控作用，其中BMP信号转导通路越来越被人们所重视。BMPs（Bone morphogenetic proteins，骨形态构建蛋白）做为TGF-β超家族的一员，不仅在骨及软骨的生成、分化、发育中具有重要的作用，而且在其他许多重要组织器官（如心、肺、脑等）均有表达，并且对多种细胞（间充质细胞、成纤维母细胞、角质化细胞、星型细胞、肾脏皮质细胞、内皮细胞以及肿瘤细等）的增殖、分化、迁移、凋亡具有重要的调控作用，并且有利于成体组织的维护与修复。其中，骨形态构建蛋白Ⅱ型受体（Bone morphogenetic proteins typeⅡreceptor，BMPR-Ⅱ）做为BMPs信号转导通路上重要的成分，在完成细胞内、外信息传递的过程中，是不可缺少的。然而，在某些疾病（如原发性肺动脉高压primary pulmonary hypertension,PPH）中及环境因素刺激下，而使正常的BMPR-Ⅱ表达下降或功能缺陷，导致信号转导的异常，从而引起肺血管细胞生长状态改变并诱发肺血管重构。骨形态发生蛋白—2（bone morphogenetic protein—2，BMP-2）做为BMPR-Ⅱ重要的激活配体，在该信号转导通路上起着决定性作用。近年来研究发现BMP-2不仅调控骨、软骨、胚胎的发生及形成，而且在调控肺动脉平滑肌细胞（PASMC）生长、增殖、凋亡、迁移、分化及基质的合成中具有重要作用，进而调控肺血管构型重建。本研究以内毒素致急性肺损伤后肺血管构型重建为立足点，重点探讨外源性BMP-2在这一过程中的作用及可能的机制，再进一步探讨对内毒素肺损伤具有保护作用的静脉麻醉药对BMP-2基因表达是否有影响。为了分层次探讨所要解决的问题，本实验分为三部分：第一部分采用直接注射rhBMP-2，考察BMP-2对内毒素致大鼠急性肺损伤后肺血管重构的作用及机制，为接下来的实验提供研究基础；第二部分在离体培养的肺动脉平滑肌细胞（PASMC）水平，模拟在体内毒素—内皮细胞损伤环境，并排除在体环境其它因素的干扰，考察外源性rhBMP-2对PASMC的增殖／凋亡的影响及机制，在细胞水平探讨BMP-2对肺血管重构的抑制作用及可能机制；第三部分主要考察静脉麻醉药对内毒素致大鼠急性肺损伤后BMP-2基因表达的影响及肺小动脉的改变，为内毒素肺损伤后临床麻醉合理用药提供理论依据。值得探讨的是，关于BMP-2信号转导通路是同时调控多种基因表达，还是以多种基因先后级联反应效应方式来影响肺血管重构，有待于进一步研究证实。材料和方法一、实验动物及试剂药品1、实验动物Wistar大鼠，雌雄不拘，由中国医科大学实验动物中心提供，体重180—260g。实验动物合格证，NO．辽实动字034。2、主要试剂及药品内毒素（Escherichina coli LPS,055：B5，美国Sigma公司）；异戊巴比妥钠（上海化学试剂采购站）；rhBMP-2（上海泽维生物公司）；Bcl-2,Bax、PCNA免疫组化一抗及标记FITC二抗试剂盒（武汉博士德公司）；原位细胞凋亡检测试剂盒TUNEL（大连博瑞德）Bcl-2，Bax的逆转录酶及PCR所需的酶、引物、TRIZOL试剂与其它试剂均购自联星生物工程公司；Bcl-2,Bax抗体（联星生物工程公司）；封闭液；洗膜液；杂交液；甲醛，ECL试剂盒；PVDF膜；其它化学试剂均为国产分析纯。胎牛血清（fetal bovine serum,FBS,大连博瑞德生物公司）；Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM培养基（大连博瑞德生物公司）；PBS，0.1％胶原酶和0.125％胰蛋白酶，青霉素、链霉素。胰蛋白酶（Trypsin，Gibco公司）；噻唑蓝（MTT，上海化学试剂站）；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）；二甲基亚砜（DMSO,沈阳化学试剂厂）；碘化丙啶（propidium iodide，PI），Sigma公司；rhBMP-2（上海泽维生物公司）；SM-α-actin抗体（武汉博士德公司）；cyclin-D1、P21抗体（武汉博士德公司）；4-氨基吡啶（4-AP，Sigma），四乙基胺（TEA，Merck）；异丙酚（阿斯利康制药），氯胺酮；BMP-2免疫组化一抗试剂盒（武汉博士德公司）；BMP-2的逆转录酶、BMP-2抗体（联星生物工程公司）；生理盐水；乳酸林格液；4％多聚甲醛；2.5％戊二醛；凝胶储备液；电泳缓冲液；PBS液，其余药品均为国内分析纯。3、主要实验仪器RM-6000多导生理监测仪（日本光电）；PTC-100型PCR扩增仪（美国）；KADAKID型凝胶呈像分析系统（美国）；GIS-700D型数码凝胶扫描分析系统（上海）；WFH-202型紫外透射仪（日本）；可见光连续光谱仪（法国）；DYY-Ⅲ31A型电泳仪（北京）；JUNG-CM1800型切片机；Olympus显微镜（日本）；OlympusAX70型显微摄像系统（日本）；Metamorph／Olympus DP10／BX 51显微图像分析系统（日本）；HITACH透射电镜。二氧化碳培养箱；酶标仪；离心机；流式细胞仪（美国BD公司）；倒置相差显微镜；荧光显微镜（日本Olympus公司）；NW-CJ-1FD型超净工作台；全细胞膜片钳记录仪。二、实验方法1、模型制备实验大鼠以1％戊巴比妥钠50 mg／kg腹腔内注射行基础麻醉后，采用内毒素小剂量恒速输入法：LPS 1mg／kg经微量注射泵30min内股静脉输入，建立急性肺损伤大鼠模型。2、细胞培养大鼠肺动脉平滑肌细胞培养（贴块法），将刮去内膜肺动脉用PBS冲洗后切割成1mm³左右的小块，将组织以3-5块／cm²的密度接种于细胞培养皿中，37℃条件下贴壁2h，加入含20％FBS的DMEM培养液1ml，37℃5％CO2的条件下静止孵育5天。待细胞长成单层，取出组织块，换液继续培养，直到细胞融合，用0.125％胰酶消化细胞，传代培养。本实验用第3～5代细胞。3、实验分组（1）第一部分实验分为三组：30只wistar大鼠，每组10只，对照组（C组）：股静脉输注0.9％生理盐水5ml在1.5h内输注完毕；内毒素（LPS）对照组（L组）：经股静脉输注生理盐水3ml 1h，然后再输注LPS1mg／kg（溶于2ml 0.9％生理盐水中），30min内输注完毕；rhBMP-2处理组（L_T组）：输注LPS1mg／kg（溶于2ml 0.9％生理盐水中），30min内输注完毕；然后rhBMP-2 10μg／kg溶于3ml 0.9％生理盐水中，经股静脉1h内输注，并且分别在24h、48h时经留置的静脉导管单次注射rhBMP-2 4μg／kg。（2）第二部分实验分为5组：Ⅰ组：EC-CM1培养；Ⅱ组：EC-CM2培养；Ⅲ组：EC-CM2+BMP-2 1ng／ml培养；Ⅳ组：EC-CM2+BMP-2 10ng／ml培养；Ⅴ组：EC-CM2+BMP-2 100ng／ml培养，均培养24h后收集细胞待测指标。（3）第三部分实验分为六组：60只wistar大鼠，每组10只。对照组（C）股静脉输注生理盐水5ml在1.5h内输注完毕；L组：经股静脉输注生理盐水3ml一小时，然后再输注内毒素1mg／kg，溶于2ml生理盐水中，30min内输注完毕；P20_L组：经股静脉预注异丙酚（经稀释）20mg／kg／h一小时，然后再输注内毒素1mg／kg（方法同上）。P50_L组：经股静脉预注异丙酚（经稀释）50mg／kg／h一小时，然后再输注内毒素1mg／kg（同上）；K20_L组：经股静脉预注氯胺酮（经稀释）20mg／kg／h一小时，然后再输注内毒素1mg／kg（同上）；K50_L组：经股静脉预注氯胺酮（经稀释）50mg／kg／h一小时，然后再输注内毒素1mg／kg（同上）。4、检测指标及方法（1）第一部分实验：透射电镜观察各组大鼠肺动脉PASMC细胞器合成情况及表型分化；显微图像分析系统测定HE染色的肺小动脉中膜厚度百分比；免疫荧光法定位Bcl-2、Bax在肺小动脉的表达；PCNA、TUNEL法检测肺小动脉PASMC增殖与凋亡；RT-PCR及western-blot法半定量检测Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的表达。（2）第二部分实验：MTT比色法观察细胞增殖率；流式细胞仪PI染色法分析细胞周期；Annexin V-FITC／PI双标法检测离体培养的PASMC早期凋亡情况；RT-PCR及western-blot法半定量检测cyclinD1、p21 mRNA及蛋白的表达；全细胞膜片钳技术检测延迟整流K⁺通道活性。（3）第三部分实验：免疫组化法定位BMP-2基因在肺血管的表达；RT-PCR及western-blot法半定量检测BMP-2 mRNA及蛋白的表达。三、统计学处理本实验采用完全随机设计（单因素设计），所有数据以（?）±s表示，用statistical anaiysis system（SAS8.1）软件包行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用student newman-keuls t检验。实验结果1、rhBMP-2对内毒素致急性肺损伤大鼠肺动脉构型重建的影响及机制（1）透射电镜观察肺血管中膜PASMC超微结构，C组正常血管壁中膜PASMC细胞内含有大量的肌丝成分，其结构致密，呈束状排列，细胞器数量较少，胞核染色质浓集，具有收缩型平滑肌细胞的典型特征，未发现肺血管构型重建特征。L组中膜平滑肌细胞的胞质中肌丝成分减少，高尔基体、线粒体、核糖体增多，说明大部分细胞已经由分化的收缩型转向合成功能旺盛的合成表型，具备发生肺血管构型重建的特征。L_T组的平滑肌细胞高尔基体、线粒体、核糖体增多减弱，表明肺血管构型重建的特征减弱。（2）与C组、L_T组比较，L组的肺小动脉中膜厚度百分比明显增加（P＜0.01），L_T组与C组比较，肺小动脉中膜厚度百分比无差异（P＞0.05）。（3）Bcl-2、Bax在C组、L组、L_T组肺小动脉中膜均有表达，绿色荧光为阳性表达。（4）L组的肺小动脉中膜PASMC增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞数增加，与C组比较增殖指数显著增加（P＜0.01），L_T组较L组显著降低（P＜0.01），与C组比较无显著差异（P＞0.05）。同时，TUNEL检测显示L组肺小动脉中膜PASMC凋亡率极低，与L_T组比较差异显著（P＜0.01）。（5）与C组比较，L组Bax mRNA的表达明显下降（P＜0.01）；与L组比较，经BMP-2处理后，L_T组Bax mRNA的表达明显增加（P＜0.01）；与C组、L_T组比较，L组Bcl-2蛋白的表达明显增加（P＜0.01）；而与之相反，Bax蛋白表达在C组及L_T组均高于L组（P＜0.01）。2、rhBMP-2对内毒素—内皮细胞条件培养液培养的肺动脉平滑肌细胞增殖／凋亡的作用及机制（1）MTT结果显示EC-CM1组PASMC未发现明显增殖，与Ⅰ组比较，EC-CM2可引起显著的PASMC增殖（P＜0.01）；与Ⅱ组比较，Ⅲ组PASMC增殖率无明显变化（P＞0.05）；与Ⅱ组比较，Ⅳ组、Ⅴ组的PASMC增殖被明显抑制（P＜0.01），（2）细胞周期分析表明Ⅰ组中S期和G2／M期的细胞很少，与Ⅰ组比较，Ⅱ组S期和G2／M期细胞比例显著增加（P＜0.01），与Ⅱ组比较，Ⅲ组S期和G2／M期PASMC比例无差异（P＞0.05），而Ⅳ组、Ⅴ组S期和G2／M期PASMC显著减少（P＜0.01）。（3）Annexin V-FITC／PI双标法测定PASMC的凋亡结果显示，与Ⅰ组比较，Ⅱ组细胞凋亡数下降（P＜0.01）；与Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组的凋亡率增加（P＜0.01）。（4）与Ⅰ组比较，Ⅱ组cyclin-D1 mRNA、蛋白表达显著增加（P＜0.01）；与Ⅱ组比较，Ⅲ组cyclin-D1 mRNA、蛋白表达无差异（P＞0.05），Ⅳ组、Ⅴ组cyclin-D1 mRNA、蛋白表达显著减少（P＜0.01）；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组p21 mRNA表达无显著差异（P＞0.05）；与Ⅱ组比较，Ⅳ组、Ⅴ组p21 mRNA表达显著增加（P＜0.01）。（5）电生理实验显示Ⅱ组的PASMC延迟整流IK强度与C组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组比较明显降低（P＜0.01）。3、静脉麻醉药对内毒素致急性肺损伤后BMP-2基因表达的影响（1）免疫组化结果显示BMP-2在肺小动脉中膜均有表达，L组的阳性表达指数与C组比较下降（p＜0.01），P_20L、P_50L、K_20L、K_50L组的BMP-2表达与C组比较也下降（p＜0.05），但与L组比较升高（p＜0.05）。（2）与免疫组化检测结果相一致，L组的BMP-2的mRNA表达量与C组比较显著下降（p＜0.01）；P_20L、P_50L、K_20L、K_50L组的BMP-2 mRNA表达量与C组比较下降（p＜0.05），与L组比较升高（p＜0.05）；但是P_20L、P_50L、K_20L、K_50L组之间的BMP-2、Bax mRNA表达量无统计学差异（p＞0.05）；与RT-PCR及免疫组化检测结果相一致，在C组BMP-2蛋白正常表达；与C组比较，L组BMP-2蛋白表达显著下降（p＜0.01）；P_20L、P_50L、K_20L、K_50L组的BMP-2蛋白表达较C组下降，但与L组比较表达增加（p＜0.05）。结论1、体内给予rhBMP-2可以通过上调Bax基因表达，下调Bcl-2基因的表达，促进了肺动脉上PASMC的凋亡，抑制了内毒素致急性肺损伤后由于PASMC异常增殖形成的肺动脉构型重建。2、内毒素—内皮细胞条件培养液可以促进离体培养PASMC增殖，一定浓度的rhBMP-2可以抑制cyclinD1的表达，促进p21的表达，同时增强延迟整流K⁺通道活性，抑制了EC-CM2培养的PASMC增殖，触发其凋亡。3、静脉麻醉药异丙酚、氯胺酮对内毒素肺损伤具有保护作用，使内毒素肺损伤后BMP-2基因表达上调。