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研究背景:前列腺癌(Pca)在西方欧美等国家是男性最常见的恶性肿瘤,其发病率在西欧国家位于男性恶性肿瘤的第二位,而病死率已成为男性恶性肿瘤患者的第一大死因。近年来,我国Pca的发病率呈逐年上升的趋势。Pca患者接受内分泌治疗1～2年后(平均中位期为18个月),自身病变往往由雄激素敏感型前列腺癌(ADPC)逐渐演化为激素非依赖性前列腺癌(AIPC),往往造成患者病情进展,症状加重,出现转移,生化指标表现为PSA的升高。二线内分泌治疗应用于对二线内分泌治疗仍有反应的AIPC患者。Pca发展成为AIPC时,Pilepich MV等[1]报道,对于AIPC患者应行二线的内分泌治疗:主要包括大剂量的比卡鲁胺200mg/日一次口服[16];肾上腺雄激素抑制剂氨鲁米特(酮康唑400mg日三次口服);雌激素治疗:已烯雌酚(1-3mg日一次口服)[2]、[3]大约20%-80%的患者症状得到改善,PSA下降50%,作用时间仅仅维持在2~6个月,因此寻找新的治疗靶点,探讨AIPC患者新的有效地治疗方案,成为近年来AIPC治疗领域的热点话题。近年来瘦素与前列腺癌的关系成为泌尿外科研究的热点课题,最新研究表明:1、肥胖容易诱发前列腺癌[42];2、瘦素水平的变化与前列腺癌相关[4 ];3、瘦素通过受体信号调控前列腺癌[7][8];4、瘦素与人体内激素相互作用影响前列腺癌的进展[9]; 5、瘦素促进血管形成影响前列腺癌的进展。瘦素作为一个多功能的细胞因子,通过不同的信号因子交互调节不同的信号传导通路,在机体组织多种生理及病理状态中都发挥着重要的调节作用,研究表明它在多种肿瘤细胞中高表达,如:乳腺癌、胃癌、前列腺癌等。临床上接受雌激素治疗的患者会由于雌激素刺激脂肪细胞促进瘦素水平的升高[10];雄激素阻断治疗会抑制睾酮分泌进而促进瘦素合成使血清中瘦素水平提高[11],国内叶洁梅[12]等的研究表明瘦素水平的提高进而促进雄激素非依赖细胞(PC-3/DU-145)的增殖。综上所述,瘦素在AIPC的发生发展过程中起了重要的作用,尤其是接受抗雄治疗失败的患者;以瘦素及其受体为靶点应用于前列腺癌治疗方面是否可以延缓AIPC的进展,成为本实验设计的出发点及落脚点,将重组人瘦素拮抗剂应用于AIPC治疗方面是本实验的创新点。目的:本实验旨在探讨:1、重组人瘦素拮抗剂对体外培养DU-145细胞株100ng/ml瘦素诱导24h后增殖活性的影响,并探讨其最适作用浓度。2、比卡鲁胺对对体外培养瘦素诱导(100ng/ml)24h后DU-145细胞株增殖活性的影响,探讨最适作用浓度。3、探讨比卡鲁胺联合应用重组人瘦素拮抗剂对DU-145细胞株细胞周期及凋亡影响,进而为比卡鲁胺。方法:1、采用体外细胞培养方法,选用中科院上海细胞库提供的激素非依赖型前列腺癌DU-145细胞株作为实验用种子细胞。2、对培养的前列腺癌DU-145细胞株进行观察。3、传代培养,取对数生长期DU-145细胞株种植96孔板,瘦素(100ng/ml)干预24h后随机分组,分为阴性对照组,瘦素干预组及药物干预组,添加不同浓度的瘦素拮抗剂及比卡鲁胺,用MTT法分别测定上述各组细胞的细胞活性(OD值),计算细胞生长抑制率,计算公式为:(1-实验组A/对照组A)×100%。4、取对数生长期DU-145细胞株,瘦素干预24h后随机分为:阴性对照组、瘦素干预组、比卡鲁胺组、瘦素拮抗剂组及比卡鲁胺联合瘦素拮抗剂组,干预24h、48h后用流式细胞仪分别检测上述各组DU-145细胞株细胞周期的变化。5、取对数生长期DU-145细胞株,瘦素干预24h后,随机分为;瘦素干预组、比卡鲁胺组及比卡鲁胺联合瘦素拮抗剂组,添加相应药物干预24h后行流式细胞术检测细胞凋亡率的变化。6、用SPSS13.0软件对实验结果进行统计学分析。结果:1.倒置显微镜下观察DU-145细胞株比卡鲁胺及重组人瘦素拮抗剂干预前后细胞形态变化。2. MTT法测定显示:在100ng/ml瘦素干预下的各组细胞的增殖活性明显优于空白对照组,重组人瘦素拮抗剂组50ng/ml时DU-145细胞株生长水平明显受抑制,细胞生长抑制率为:15.86%±0.8%,继续加大剂量并无明显抑制DU-145细胞生长的作用。3.MTT结果显示:(1)不同浓度的比卡鲁胺干预组DU-145细胞株均被明显抑制,随药物剂量增大细胞生长抑制率逐渐提高,各组差异有极显著性(P<0.01);(2) 24h及48h细胞抑制率无显著差异(P>0.05),随着时间延长DU-145细胞增殖抑制作用无明显变化。4.流式细胞术细胞周期测定结果显示:4.1瘦素干预下的DU-145细胞较空白对照组G2及S期细胞比率增高,G1期细胞比率下降,不同时间(24h/48h)差异无显著性(P>0.05)。4.2瘦素拮抗剂组较瘦素干预组有显著差异(P<0.05),DU-145细胞G2及S期细胞比率明显下降,尤以S期下降更为明显;G1期细胞比率增高,不同时间段(24h/48h)细胞周期差异无显著性(P>0.05),随时间延长G1细胞比率增高。4.3比卡鲁胺组较瘦素干预组有显著差异(P<0.05),DU-145细胞G2期细胞比率明显下降,S期细胞比率无明显下降,G1期细胞比率明显升高,随时间延长G1期细胞比率继续增高,G2期细胞比率继续下降,24h及48h不同时间段之间细胞周期变化经T检验分析无显著差异(P>0.05)。4.4比卡鲁胺联合重组人瘦素拮抗剂组较瘦素干预组及空白对照组细胞周期变化均有极显著差异(P<0.01);较比卡鲁胺组DU-145细胞G1期无明显变化,S期细胞比率下降;较瘦素拮抗剂组DU-145细胞G1期无明显变化,G2期细胞比率下降;比卡鲁胺联合重组人瘦素拮抗剂组较比卡鲁胺组及瘦素拮抗剂组不同时间段之间(24h/48h)细胞周期变化差异无显著性(P>0.05)。5、流式细胞术测细胞凋亡:凋亡检测结果显示:比卡鲁胺组及比卡鲁胺联合应用瘦素拮抗剂组均较空白对照组凋亡比率明显增高,有极显著性差异(P<0.01);比卡鲁胺联合应用瘦素拮抗剂组较比卡鲁胺组表现出更明显的促细胞凋亡效应。结论1、重组人瘦素拮抗剂可抑制DU-145细胞增殖,无时间依从性;更多将DU-145细胞阻滞在G1期,S期细胞比率下降显著。2、比卡鲁胺抑制DU-145细胞株增殖,将DU-145细胞阻滞在G1期,G2期细胞比率下降显著。3、比卡鲁胺联合应用重组人瘦素拮抗剂明显抑制DU-145细胞增殖,更多的阻滞在G1期,促进DU-145细胞凋亡。