基质辅助激光解离飞行时间质谱(MALDI-TOF—MS)是二十世纪八十年代发展起来的一个新的快速分析大分子的方法。发展到今天，MALDI-TOF—MS已经广泛地应用于各种各样的领域，如鉴定多肽、蛋白质、寡糖、寡核苷酸、聚合物、C60、一些配合物等。尤其是在生物分子的检测方面，MALDI-TOF—MS发挥着越来越重要的作用，如蛋白质组学、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质翻译后修饰的研究，以及在疾病标志物的发现与鉴定、新药的发现与鉴定、药物作用靶点的分析、分子生物学等领域。对于纯的样品，MALDI-FOF—MS能够分析样品晕低至femtomole(10-15)到attomole(10-18)的样品。但是在实际分析样品时，样品来源都是非常复杂的体系如血液、细胞溶解物、组织、培养液等，其中含有大量的蛋白质、盐、表面活性剂、防腐剂等杂质，这些复杂的样品很难或者几乎不可能直接用MALDI-TOF—MS米进行分析。此外，MALDI-TOF—MS分析复杂样品时存在离子互相抑制效应，样品本身的疏水性和酸碱性质也极大地影响离子化效率，因此需要预先对样品进行分离，然后进行MALDI-TOF—MS表征。而探索高效的将分离手段和MALDI-TOF—MS直接耦合起来的方法显得非常重要。本论文目的是研究将在线分离手段耦合基质辅助激光解吸离子时间飞行质谱在生物分子检测中的应用。本研究分为二个部分讨论。 第一部分：脑钠肽的亲和捕获和MALDI-TOF—MS表征。脑钠肽(BNP)又称B型利钠肽，是继心钠肽(ANP)后利钠肽系统的又一成员，由于它首先是由日本学者Sudoh等于1988年从猪脑分离出来因而得名，实际上它主要米源于心室。BNP具有重要的病理生理学意义，它可以促进排钠、排尿，具较强的舒张血管作用，可对抗肾素—血管紧张素—醛固酮系统的缩血管作用，同ANP一样是人体抵御容量负荷过重及高血压的一个主要内分泌系统。BNP同ANP一起参与了血压、血容量以及水盐平衡的调节，提高肾小球滤过率，利钠利尿，扩张血管，降低体循环血管阻力及血浆容量，这些均起到维护心功能作用。BNP主要在心室合成，在心室负荷过重或扩张时增加：因此反映心室功能改变更敏感、更具特异性，因BNP前体并不储存于分泌颗粒，BNP的合成与分泌的快速调节在基因表达水平上进行。心衰时，心脏容量负荷或压力负荷增加，心肌受到牵张或室壁压力增大，使血中BNP浓度增高，故可协助诊断心衰。心衰是多种疾病的终末阶段，心衰可分急性心衰和慢性心衰(CHF)，CHF根据纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。BNP在血液中的浓度和心衰严重程度有着正相关性。当BNP的浓度水平高于100pg/mL时将导致心脏不适，而浓度高于480pg/mL时将导致心脏失能或梗死。因此寻找一种快速、方便、价格低廉的方式米检测人血清中的BNP浓度变得非常重要。目前采用的免疫学的方法如放射免疫方法和荧光免疫方法已经能够进行快速的分析，但是他们的一个重要缺点就是分析的是BNP和其前体的累加浓度，而不是单一的BNP浓度。然而质谱分析能够获得样品的准确分子量及其浓度信息。我们的工作研究了从血清中分离提纯BNP并进行MALDI-TOF—MS鉴定：(1)设计了NHS修饰的多孔硅表面米同定抗体在靶表面。NHS是氨基活性的交联基团，和抗体中的自由氨基反应，将抗体固定在多孔硅的表面。我们分别用傅立叶变换红外光谱、X射线光电子能谱、酶联免疫吸附方法分析了固定抗体的结果。实验结果表明，抗体稳定的固定在多孔硅的表面，同时保留了其生物活性来亲和捕获抗原的能力。(2)比较了不同抗体亲和捕获BNP的能力，以及分析了表面的特异性捕获能力。我们选择非BNP抗体B2-3，BNP抗体5E8、D2米比较了不同表面的亲和捕获能力。分析的结果表明，我们的表面能够特异性捕获BNP，同时消除了非特异性吸附BNP的现象。此外为了分析5E8因化学固定而失活的可能性，我们选择先在表面固定羊抗鼠免疫球蛋白来亲和同定5E8，再来亲和捕获BNP。研究表明，由于多孔硅的孔径比较小，同时免疫球蛋白的体积比较大，不容易和富集在孔内的NHS基团反应而固定在MALDI靶的表面，导致表面活性抗体与直接固定5E8的方法相比更少。另一个原因是固定到表面时免疫球蛋白体积大，也导致了同等面积固定的抗体更少。MALDI-TOF—MS表征的结果表明此方法不如直接固定5E8的方法。(3)用修饰5E8的多孔硅从不同浓度的纯BNP溶液中亲和捕获BNP，并用MALDI-TOF—MS表征。实验结果表明，获得的质谱信号强度和BNP溶液的浓度有一定的线性关系。表面添加基质时基质分散不均匀导致不同位点获得的质谱信号不均匀，降低线性关系。此外，BNP浓度越低时，亲和捕获的效果越明显。(4)利用修饰5E8的MADLI靶从病人的血清中亲和捕获BNP米分离和浓缩BNP，并进行MALDI-TOF—MS分析。研究表明，MALDI靶能够分析血清中浓度低至10pg/mL的BNP。但是由于质谱本身的离子互相抑制效应，导致质谱峰强度和BNP浓度的线性关系降低。可以通过同位素标记的方法米提高样品中BNP浓度和质谱峰强度的线性关系。此外，在亲和捕获到BNP的同时，修饰5E8的多孔硅靶也能捕获到BNP的前体proBNP。 第二部分人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的新陈代谢基质的差异蛋白质组学分析。蛋白质组学是后基因组时代的一门新兴学科，由基因组学在逻辑上发展而来，指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式；但与基因组的稳定性相比，蛋白质组则具有可变、多样的特点，对于同一机体的各种细胞，其基因组是稳定的，而蛋白质组则各不相同，即使同一细胞，在不同生理或病理环境中，其蛋白表达也是不同的。蛋白质组的这种特点，恰恰为差异蛋白质组的出现与兴起奠定了逻辑基础，差异蚩白质学研究的理论假设是承认某一细胞或组织在发生某种止常或异常变化时，其蛋白质组会发生相应的、有规律的改变，比如在乳腺发生癌变时，假设某些蛋白会有规律地发生变化，那么将乳腺癌样本与正常样本进行比较，应有呈规律变化的蛋白，如能对此类蛋白进行验证，进一步证明其与该病理变化紧密相关，则可认为差异蛋白是这种变化的一类标志性蛋白。因此，它对临床上肿瘤预诊、药物靶标寻找、细胞调控分子鉴别等均有着极大的实际意义。自1971年Folkman首先提出“肿瘤生长、转移都依赖于血管生成，抑制血管生成能抑制肿瘤生长”以米，有关肿瘤血管生成方面的研究已经取得了巨大的进展。现在发现的肿瘤血管的形成方式主要有以下几个方式：出芽式血管生成、套叠式血管生成、成血管细胞募集、血管选定、镶嵌体血管以及血管生成拟态等。肿瘤新生血管形成过程大多数依赖于血管内皮细胞的增殖、移行、粘附、侵入细胞外基质等几个阶段，由于内皮细胞较其他细胞更易接触到血管内的药物，且内皮细胞具有遗传稳定性和不易突变为耐药的突变体等特点，研究肿瘤血管内皮细胞和正常血管的内皮细胞之间蛋白质组学的差异，对分析寻找控制肿瘤血管形成的方法以及寻找药物作用靶蛋白质具有重要意义。人脐静脉内皮细胞(HuVEC)是最常用的人血管内皮细胞的生物体外模型。利用MALDI-TOF—MS研究了HUVEC细胞在不同培养条件下，培养基底上蛋白质组学的变化，寻找与肿瘤血管内皮细胞生长相关的可能生长因子或者药物作用的靶蛋白。