蒺藜苜蓿作为豆科模式植物,具有相对简单的复叶模式,并且能够与根瘤菌互作产生根瘤,因此是研究植物复叶发育模式和植物菌根共生固氮的理想材料。同时,蒺藜苜蓿是二倍体植物,基因组小,且相对简单,有相对成熟的遗传转化体系,因此以蒺藜苜蓿为模式植物来研究叶发育模式并将其运用到牧草紫花苜蓿的品种改良中具有重要意义。由于豆科植物共生固氮能够减少氮肥使用,同时也能够减少环境污染,因此在蒺藜苜蓿中研究根瘤产生的机理,提高共生固氮的水平并将其运用到其它作物中能够对提高作物产量和改善环境产生积极意义。叶片是被子植物重要的营养器官,根据叶柄着生叶片的数量,植物被分为单叶和复叶植物。复叶植物中小叶的产生需要在已经起始的叶原基中再起始小叶原基,因此单叶和复叶植物中叶原基的起始和发育机制有显著不同。现有的研究表明在番茄、碎米芥中的复叶发育模式和豆科植物如蒺藜苜蓿和豌豆中的也不同。因此,关于植物复叶发育模式调控的分子机制还有很多方面需要探索。本研究包括3部分内容。1.我们通过正向遗传学方法筛选了影响胚发育时期顶端分生组织维持和幼年叶叶原基起始的突变体additional juvenile leaf 1-1（ajl1-1）,并研究了AJL1在蒺藜苜蓿幼年叶叶原基起始调控中的功能。2.我们通过正向遗传学筛选了蒺藜苜蓿复叶发育异常的突变体,定位到突变基因是拟南芥LATERAL SUPPRESSOR（LAS）在苜蓿中的同源基因,并且研究了该基因及其同源基因在复叶发育模式中的功能,以及MtLAS1基因与其它复叶发育基因之间的关系。3.由于物种差异,在不同的基因调控网络和生长环境下,同源基因在不同物种中往往有不同的功能,因此特定基因在不同物种中的功能还有待研究。我们发现拟南芥中能影响各轮花器官发育的HANABATARANU（HAN）基因在蒺藜苜蓿中的同源基因MtHANs不参与蒺藜苜蓿的花发育,而是参与了蒺藜苜蓿根瘤发育的调控。本文的主要研究结果如下:1.AJL1在蒺藜苜蓿幼年叶发育中的功能研究通过正向遗传学方法,我们在蒺藜苜蓿突变体库中筛选到了幼年叶数目增多的突变体ajl1-1,扫描电子显微镜观察显示,ajl1-1突变体幼年叶叶原基起始于胚发育时期,并且该突变体SAM维持出现缺陷,导致种子和胚中SAM显著变大。蛋白比对和进化分析表明,AJL1编码拟南芥CLAVATA3/ESR-RELATED（CLE）家族基因的同源蛋白。通过研究AJL1基因的表达模式,发现AJL1在SAM的CZ区特异表达。qRT-PCR和原位杂交检测显示,在ajl1-1突变体中,MtWUS基因的表达显著上调。同时mtwus-1突变体也会影响幼年叶叶原基的起始。遗传分析表明,AJL1通过抑制MtWUS基因的表达来参与胚发育时期SAM的维持,进而影响幼年叶叶原基起始。通过原位杂交我们发现MtPIN1/SLM1特异性地在幼年叶叶原基起始部位表达。同时,在ajl1-1突变体背景下突变SLM1能够抑制胚发育时期幼年叶叶原基的起始。说明ajl1突变体中异常幼年叶叶原基的起始依赖于SLM1介导的在叶原基起始处生长素浓度的最大化。AJL1作为一种CLE家族的分泌肽,能够通过MtCLV1受体参与SAM维持。同时,我们发现拟南芥BARELYANYMERISTEM（BAM）同源基因的突变体mtbam1-1和mtbam2-1都有类似于ajl1-1突变体的表型。暗示AJL1可能通过MtBAM1和MtBAM2受体参与顶端分生组织维持和幼年叶叶原基起始。我们还发现MtREV1也能通过调控顶端分生组织维持参与幼年叶叶原基起始。mtrev1-1突变体胚发育时期也能起始2个幼年叶叶原基。在ajl1-1突变体中过表达MtREV1能够恢复ajl1-1突变体的表型,说明MtREV1可以抑制ajl1-1的缺陷。该研究扩展了我们对胚发育时期叶原基起始的认识。2.MtLAS基因在蒺藜苜蓿复叶发育中的功能研究通过正向遗传学方法,我们在Tnt1突变体库中筛选到了 2个复叶模式发育异常的突变体株系。野生型叶片通常由3个小叶组成,与野生型相比,该突变体会产生包含两对侧叶和一个末叶的5个小叶的叶片。通过Tnt1转座子关联分析发现该突变基因是拟南芥LAS在蒺藜苜蓿中的同源基因,我们将其命名为MtLAS1。进化树分析表明,蒺藜苜蓿中还有另外一个基因与该基因进化关系较近,我们将其命名为MtLAS2。通过杂交的方法,我们构建了它们的双突变体。结果显示,双突变体小叶增多叶片比例显著增加,说明两个基因在调控复叶发育中存在功能冗余。扫描电子显微镜观察发现,异位起始的叶原基位于侧叶原基和末叶原基之间的小叶柄处。相对于野生型,mtlas1-1 mtlas2-1双突变体叶片面积、叶柄和小叶柄长度增加。组织器官表达检测显示,MtLAS1在植物茎顶端和花中的表达量最高,在其它器官中的表达量相对较低。MtLAS2基因在茎顶端、花和果荚中表达相对较高,在其它组织中表达相对较低。用MtLAS1和MtLAS2的启动子驱动GUS报告基因转化蒺藜苜蓿野生型,发现MtLAS1基因在萌发种子的根尖、植物幼叶、托叶、花中表达较高,在成熟叶中表达较低,MtLAS2在萌发种子的根尖、幼叶、植株茎和叶柄之间的边界区域和花中表达,在成熟叶中表达较低。原位杂交表明,MtLAS1和MtLAS2基因在SAM和叶原基之间的边界区域特异表达。通过构建过表达转基因株系,我们发现35S:MtLAS1和35S:MtLAS2转基因株系叶柄和小叶柄长度变短。通过与已知的参与蒺藜苜蓿复叶发育的基因的突变体杂交,我们发现MtNAM、FCL1和SGL1在遗传上均上位于MtLAS1和MtLAS2。表明mtlas1-1 mtlas2-1双突变体中异常小叶原基的起始依赖于MtNAM、FCL1和SGL1。同时我们发现MtUFO的突变能够恢复mtlas1-1 mtlas2-1双突变体的表型。通过在野生型中过表达MtUFO,能够模拟出mtlas1-1 mtlas2-1双突变体的表型,说明MtLAS1和MtLAS2能够通过调控MtUFO参与复叶发育。然而qRT-PCR表明,在mtlas1-1 mtlas2-1双突变体和35S:MtLAS1株系中MtUFO的表达均没有发生变化,说明MtLAS1和MtLAS2并不能通过转录水平调控MtUFO的表达。同时我们发现在35S:MtUFO背景下过表达MtLAS1能够部分抑制35S:MtUFO的表型,说明MtLAS1通过蛋白水平调控MtUFO的功能。以上研究证实了MtUFO参与 inverted repeat lacking clade（IRLC）分支豆科作物的复叶发育,同时发现MtLAS1通过蛋白水平调控MtUFO的功能。该研究为研究豆科植物复叶发育模式机理和后期牧草改良提供参考。3.MtHANs在蒺藜苜蓿根瘤发育中的功能研究豆科植物能够通过与根瘤菌互作产生有固氮功能的根瘤。由于根瘤的产生是一种耗能行为,因此植物会通过AON途径精确调控根瘤数目。高浓度的氮素会通过激活AON途径来抑制根瘤的起始。当环境中氮素浓度高时,根瘤起始和发育的各个阶段均会被影响。在拟南芥中,HAN基因能够响应氮元素,调控叶绿素含量。同时,han突变体会影响各轮花器官的发育。通过蛋白序列比对和进化树分析,我们找到了HAN在蒺藜苜蓿中的同源基因MtHAN1和MtHAN2。同时通过反向遗传学方法,我们在Tnt1突变体库中筛选到了MtHAN1和MtHAN2的突变体。结果发现,mthan1和mthan2突变体不影响蒺藜苜蓿叶和花发育。考虑到同源基因间的功能冗余,我们构建了mthan1 mthan2双突变体,结果发现mthan1 mthan2双突变体依然没有花发育缺陷的表型,暗示了MtHAN1和MtHAN2在蒺藜苜蓿发育中具有其它功能。通过分析MtHAN1和MtHAN2在不同组织器官中的表达模式,我们发现MtHAN1和MtHAN2在根中有表达。通过构建启动子与GUS融合表达载体,我们发现MtHAN1和tHAN2在蒺藜苜蓿根尖,侧根原基和根维管束中有表达。通过在不同发育时期的根瘤中检测MtHAN1和MtHAN2的表达,我们发现MtHAN1和MtHAN2基因的表达会随着根瘤的发育发生变化。为了研究MtHAN1和MtHAN2在根瘤发育中的功能,我们在单突变体和双突变体中进行了根瘤诱导。结果显示,mthan2单突变体和mthan1 mthan2双突变体中的根瘤数目显著增加。同时我们发现mthan1 mthan2双突变体不影响根瘤形态结构和固氮酶活性。同时我们也构建了35S:MtHAN1和35S:MtHAN2的转基因株系,发现过表达株系不影响植株的叶片和花发育。在过表达植株中诱导根瘤表明,过表达MtHAN1和MtHAN2基因也不影响根瘤形态和固氮酶活性。为了研究MtHAN1和MtHAN2基因如何参与根瘤发育,我们对野生型和mthan1 mthan2双突变体的成熟根瘤进行了转录组分析。结果显示,与根瘤形成过程中相关的许多物质合成途径和植物激素信号转导途径都受到影响。同时我们发现在mthan1 mthan2双突变体根瘤中,许多与多肽合成加工相关的肽酶和肽酶抑制剂基因的表达发生变化。同时,MtHANs能够直接或间接调控NCR基因Medtr1g042940,Medtr5g072205 和 Medtr5g072275 的表达。该研究证明了拟南芥中HAN在蒺藜苜蓿中的同源基因MtHANs具有与拟南芥中不同的功能,同时也为研究豆科植物中根瘤形成调控提供参考。