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研究表明激肽,激肽-缓激肽系统在心脑血管系统疾病、糖尿病及其并发症、肿瘤等起作用,此外我们的前期研究证实,人激肽释放酶在血液中的含量与缺血性脑中风的相关性显示其可以作为脑卒中体外诊断的一项重要参与指标。鉴于多项研究及我们前期所作实验的结果,我们研发针对人组织激肽释放酶的试剂盒。[目的]开发激肽释放酶含量测定ELISA试剂盒,用于诊断缺血性脑卒中、冠心病、糖尿病等疾病。[方法](1)以pcDNA-HK为模板,用特异性引物PCR扩增KLK1目的基因,将鉴定结果为阳性的目的基因的重组质粒HK/4T1转化大肠杆菌DH5α,进行人组织激肽释放酶融合蛋白(HK-4T1)的原核表达及纯化,并且进一步优化条件。(2)单克隆抗体制备,以杂交瘤细胞注射小鼠,诱生腹水产生的单克隆抗体效价可到1：1×10∧5。用AKTA系统纯化后能得到纯度高、效价高的抗体,可用于ELISA检测。(3)制备多克隆抗体用于KLK1试剂盒包被孔板,以提高试剂盒检测的准确性。同时用未包被的酶标板做直接法ELISA实验。[结果](1)将IPTG诱导表达的菌体进行SDS-PAGE电泳,与蛋白标准品比较,在相对分子质量55KDa处可见明显的高表达带。免疫印迹实验表明重组蛋白具有KK的抗原性。(2)相对于细胞培养基上清,小鼠腹水产生的单克隆抗体较易获得纯度高,效价高的抗体。(3)多抗包被的孔的OD值随着抗原浓度的降低有下降趋势,但线性关系较差；直接法的OD值在0.75ug/ml浓度以下的线性关系较好。[结论]已经成功克隆并表达人组织激肽释放酶基因,在最佳条件下,初分离产品中,绝大部分比重为目的蛋白包涵体,对初产品的精细分离采用排阻色谱和亲和色谱完成,以便进一步提高目的蛋白的比重,已经初步建立起对人组织激肽释放酶的高效ELISA检测试剂盒,为下一步进行血浆激肽释放酶含量的检测做好铺定,接下来的工作主要集中在将产品工业化及提高测试方法的精确度及可重复性上