慢性、难愈合的伤口或创面在临床较为常见,目前临床上尚缺乏简便有效的治疗方法,究其根源是因为我们对创面难愈合的机理尚未完全明了,因此对创面愈合机理的研究受到越来越多的重视,本课题希望通过研究难愈合创面中巨噬细胞对血管内皮细胞的作用,揭示难愈合创面的可能机制以及巨噬细胞在其中的地位和作用。各种创伤修复均要经过炎症期、增生期和塑形期,在增生期,新生的肉芽组织通过丰富的新生毛细血管网络向局部组织提供氧和所需的营养物质,血管内皮细胞作为血管的重要组成成分,受许多血管生成因子的作用而发生趋化、迁移和增殖,在局部形成新的血管芽,这些血管芽相互吻合、再通,导致创面的肉芽化,促进毛细血管网的形成,因而血管内皮细胞是创面修复的中心环节之一。作为创面修复中的另一种重要细胞——巨噬细胞,由单核细胞游走到外周组织后分化而成,它不仅在创面愈合的炎症期发挥提呈抗原、吞噬、消化、杀伤作用,而且还可以合成、分泌多种生物活性介质,促进中性粒细胞、成纤维细胞、成骨细胞和血管内皮细胞等多种细胞的迁移、增生,促进血管和肉芽组织的形成,从而在创面愈合的炎症期和增生期均发挥重要作用,也因此受到生理性和病理性血管生成的研究者的极大关注。因此,研究在创面愈合中巨噬细胞对血管内皮细胞的作用有着重要的理论和实践意义。大剂量的电离辐射可以引起创面难愈合,难愈合的机制目前尚不甚明了。很早就知道电离辐射可以引起机体的炎症反应,这种炎症反应大部分是由于放射后表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和单核巨噬细胞等细胞间的相互作用,通过自分泌或旁分泌产生的炎性细胞因子介导的,这些炎性细胞因子与大剂量电离辐射所致的创面难愈合有着直接或间接的关系,巨噬细胞作为这些炎性细胞因子的重要分泌细胞之一,在电离辐射所致的难愈合创面中的具体作用和地位不是很清楚。TGF-β1是巨噬细胞分泌的细胞因子之一,对于体外血管内皮细胞的血管生成作用显示出剂量依赖性,并具有双向调节作用,低浓度(<0.5ng/m l)的TGF-β1可以促进内皮细胞的迁移,加强血管生成;而高浓度(>0.5ng/ml)的TGF-β1则抑制内皮细胞的迁移,抑制由bFGF、VEGF所诱导的内皮细胞的血管生成作用,抑制血管生成。VEGF是体内重要的血管生成诱导因子<WP=11>之一,它可以刺激内皮细胞合成蛋白酶,促进内皮细胞迁移和增殖,它介导的信号转导是通过VEGF受体完成的,目前认为,参与血管生成的VEGFR主要有两个:VEGFR-1(Flt -1)和VEGFR-2 (KDR / Flk-1);VEGFR-1主要与EC的粘附、维持血管通透性有关;VEGFR-2与EC增殖、分化有关。在VEGF刺激下,KDR可以迅速被磷酸化,磷酸化的KDR通过激活PKC- MAPK旁路,促进内皮细胞的有丝分裂和增殖,同时,活化的KDR还可以通过激活PI3K/Akt,Ras/Raf/MEK/ERK等通路,提高凋亡调节蛋白Bcl-2/Bcl-XL、Survivin/XIAP、NO等的浓度,从而抑制内皮细胞的凋亡,促进内皮细胞的存活。因此,研究放射损伤条件下,巨噬细胞影响内皮细胞生物学性状的可能机制,以及TGF-β1和VEGF/VEGFR在其中的作用,有利于丰富细胞网络和创面修复理论,深入认识难愈创面的机理,进而为促进创面愈合和调节病理状态下的血管生成提供理论基础,为下一步更深入的研究难愈创面机理、寻找促愈措施和调节血管生成提供理论依据。本课题为国家重点基础研究发展规划项目“严重创伤早期全身性损害与组织修复的基础研究”中“创伤修复失控发生机制研究”的子课题。 本课题首先探讨了脂多糖(LPS)作为巨噬细胞U937刺激剂的最佳刺激浓度,然后建立了人巨噬细胞系(U937)分别和人脐静脉内皮细胞系ECV-304、原代培养的脐静脉内皮细胞(HUVEC)的共培养模型,同时观察了在12Gy60Coγ射线照射后,血管内皮细胞在有或无U937作用下的不同变化,分别运用倒置显微镜和HE染色的方法观察了巨噬细胞对两种细胞形态学的影响;采用MTT法观察对细胞增殖的影响;采用流式细胞技术测定细胞周期和细胞凋亡的变化;采用ELISA法检测细胞分泌VEGF、TGF-β1的变化;采用免疫荧光+流式细胞技术和RT-PCR法检测血管内皮细胞膜上VEGF受体KDR在蛋白水平和mRNA水平的表达变化。结果表明:1、U937在未经LPS刺激的情况下,具有分泌TGF-β1和VEGF的能力;2、与0.0 μg/ml时比较,当LPS低浓度(0.1、1.0、10.0 μg/ml)时,可以促进U937的增殖,增强细胞分泌TGF-β1的能力,在促进细胞增殖的同时凋亡细胞也增加,但对VEGF的分泌无明显影响;当LPS高浓度(50、100μg/ml)时,对U937的增殖无促进作用,促进细胞凋亡的作用明显加强,细胞分泌TGF-β1和VEGF的能力也有所增加;3、经12Gy60Coγ射线照射后,ECV-304的细胞体积增大,形态多样化,有褪变细胞的形态,主要表现为核固缩、核碎裂及核溶解,有时可见杆状核,胞浆嗜酸性增<WP=12>强,偶见胞浆空泡化;细胞增殖率降低,凋亡增加,G2期阻滞,细胞分泌VEGF和TGF-β1增加, KDR的表达有所提高;4、12Gy60Coγ射线照射后、与巨噬细胞(U937)共培养48h的ECV-304细胞形态也呈现与照射后相似的褪变性变化,但程度明显减轻;同时,与巨噬细胞共培养48小时的ECV-304的细胞增殖率高于单纯照射后的细胞的增殖率,细胞凋亡和G2期阻滞较之减轻, VEGF的分泌和KDR的表达增加, TGF-β1的分?