论文部分内容阅读
本研究旨在探索产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)感染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)诱导的microRNA(miRNA)表达谱变化,揭示关键候选miRNA的生物学功能及分子机制,为解析宿主miRNA在ETEC感染过程中的调控作用提供理论基础。利用Illumina 6000 Novoseq SE50测序平台分别对ETEC感染前(bi)、感染初期(pi4h)和感染末期(pi18h)的IPEC-J2细胞进行高通量测序,并利用Bowtie与参考基因组比对。经过滤,bi、pi4h和pi18h的sRNA文库分别得到12 889260条、13 113 174条、11 203 056条纯净序列,测序质控良好。测序共发现311个已知miRNAs,128个新miRNAs。利用DESeq R Package进行miRNA差异分析,感染初期较感染前(pi4hvsbi)共筛选出46个差异表达miRNAs,其中35个miRNAs表达上调,21个miRNAs表达下调;感染末期较感染前(pi18h vs bi)共筛选到140个差异表达miRNAs,其中74个表达上调,66个表达下调;感染末期较感染初期(pi18hvspi4h)共筛选到101个差异表达miRNAs,其中47个表达上调,54个表达下调。实时荧光定量PCR验证结果表明,随机选取的8个miRNAs表达趋势与测序结果一致,表明测序准确可靠。通过miRanda和RNAhybid共同预测差异表达miRNAs的靶基因,并对差异表达miRNA靶基因进行GO和KEGG分析。GO分析表明,miRNA靶基因显著富集于代谢过程、正向调节代谢过程、细胞组成和免疫系统等功能。KEGG分析显示,差异表达miRNA靶基因显著富集于肿瘤坏死因子信号通路、生产IgA的肠道免疫网络、NF-κB信号通路和T细胞受体信号通路等。上述结果表明,猪小肠上皮细胞miRNAs在ETEC的感染进程中,广泛参与了细胞组成、代谢和免疫调控等多种生物学功能,为进一步揭示调控ETEC感染的关键miRNA及其作用机制提供科学依据。进一步对差异表达miRNAs进行筛选,发现ssc-miR-155-3p在pi4h vs bi、pi18h vs bi和pi18h vs pi4h三组中差异表达倍数值log2(Fold Change)分别为1.839 5、-0.3943 8、-2.270 7,在感染初期显著上调(P<0.001),感染末期显著下调(P<0.001)。结合差异表达倍数、功能及通路富集分析、预测的靶基因及文献支持,推测ssc-miR-155-3p可能是调控ETEC感染的关键候选miRNA。进而利用ssc-miR-155-3p mimics或inhibitor转染IPEC-J2细胞,上调或抑制其表达,并通过MTT实验和流氏细胞术证实ssc-miR-155-3p抑制ETEC感染诱导的IPEC-J2细胞凋亡。通过miRanda和RNAhybrid对ssc-miR-155-3p进行靶基因预测,取交集共得到3个预测靶基因,分别为ZNF341、CD163和SLA-7。通过RT-qPCR及双荧光素酶报告基因方法确定ZNF341为ssc-miR-155-3p直接结合的靶基因,ssc-miR-155-3p可靶向下调ZNF341 mRNA表达水平。向IPEC-J2细胞分别转染ssc-miR-155-3p inhibitor、ZNF341 siRNA 及二者共转染,结果表明 ZNF341 介导了 ssc-miR-155-3p对IPEC-J2细胞凋亡的抑制作用。我们进一步证实敲低ZNF341后可导致STAT3表达下调,初步证实STAT3为ZNF341下游效应因子,而已知STAT3为细胞凋亡的重要调控因子。上述结果表明,ssc-miR-155-3p可能靶向ZNF341/STAT3轴抑制ETEC诱导的IPEC-J2细胞凋亡。综上所述,本研究揭示了猪小肠上皮细胞ssc-miR-155-3p抑制ETEC诱导宿主细胞凋亡的作用及其分子机制,为阐明miRNA在病原体-宿主互作过程中发挥的调控作用提供了理论基础,为寻找防治仔猪腹泻的新靶点提供了参考。