论文部分内容阅读
光对生物体光合作用和生长发育具有重要作用,藻类的生长和发育与光有密切关系。隐花色素(cryptochrome,CRY)是一种接收蓝光(440～460 nm)与近紫外光UVA(320～400 nm)的光受体,属于隐花色素/光修复酶家族,参与了动物、植物乃至微生物中的光反应及生物钟的调控。目前对隐花色素的研究主要集中在陆生植物,对植物隐花色素结构、生物学功能、光激发及信号转导调控机制研究方面取得长足进展,但对海洋微藻隐花色素研究较少,尤其尚未见极地海洋微藻隐花色素的相关研究。南极衣藻长期在低温、高盐、季节性光照和强紫外辐射等海冰环境中生长和繁殖,对低温、高盐等逆境具有很强的适应能力。本文率先开展南极衣藻隐花色素研究,不仅有助于了解南极衣藻隐花色素的功能和作用机理,阐释海洋藻类光调节过程,还可为研究极地藻类对极端环境的适应性奠定基础。目的:本研究主要开展南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L隐花色素基因克隆及表达调控研究,明确C.sp.ICE-L隐花色素蓝光信号的响应及其在调节节律性光过程中的作用,探讨南极衣藻隐花色素受光诱导的调控功能,探索南极衣藻生物钟的调控机制,为进一步探讨南极冰藻环境适应的分子机理奠定理论基础。方法:1.根据南极衣藻C.sp.ICE-L转录组测序结果,通过分子生物学技术克隆隐花色素基因CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1,并进行生物信息学分析。2.选取温度、盐度、光质、光周期、紫外条件对南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因进行实时荧光定量PCR分析,检测其转录调控水平。3.构建南极衣藻隐花色素基因CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1原核表达体系。4.通过Water-PAM测定南极衣藻在不同条件(紫外UVA和UVB、不同光质和光周期)的叶绿素荧光参数,分析细胞的最大光化学效率(Fv/Fm)和非光化学猝灭(NPQ)。结果:1.克隆获得南极衣藻隐花色素基因Ci CRY-DASH1和CiPlant-CRY1全长,并进行初步生物信息学分析。CiCRY-DASH1有1836个碱基对,编码608个氨基酸,其蛋白分子量为67.35 kDa;CiPlant-CRY1有1452个碱基,编码483个氨基酸,其蛋白分子量为52.32 kDa。系统发育树分析表明CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1与莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii以及绿藻属C.subellipsoidea C-169的进化关系最近。2.完成了南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因的实时荧光定量PCR分析。研究结果表明,CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因在低温处理与最适温度下转录变化都有一定的趋势,即具有温度补偿性,进一步证实其为生物钟的关键组分。CiCRY-DASH1和Ci Plant-CRY1基因在最适盐度32‰时的表达量最高,且呈现一定的规律性。CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因在不同光质(白光、蓝光、绿光、黄光和红光)下的表达量可以发现,它能有效地响应各种不同光质的处理,特别是蓝光、黄光和红光,表明它可能参与了蓝光、黄光甚至是红光下的光信号转导途径。CiCRY-DASH1和Ci Plant-CRY1基因的表达能响应极昼和极夜处理,且响应能力强,并表现出一定的昼夜节律性。在紫外胁迫条件下,CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因对UVB和紫光敏感。3.构建了南极衣藻CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1基因的原核表达体系。成功构建原核表达载体pEASY~?-Blunt E2-Ci CRY-DASH1和pEASY~?-Blunt E2-CiPlant-CRY1,并将其转化到Transetta(DE3)表达感受态细胞中,在IPTG(isoproptl-β-D-thiogalactoside)作用下低温16℃诱导12 h。经SDS-PAGE电泳分析得到与预测蛋白分子量相同的目标蛋白CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1,表达后的目的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。4.完成了南极衣藻叶绿素荧光特征分析。研究发现UVB、蓝光和极昼条件是可能影响极地环境中藻类的生理和代谢的胁迫条件;在UVB、蓝光和极昼条件下,南极衣藻C.sp.ICE-L的最大光化学效率Fv/Fm随着胁迫时间的增加而逐渐下降,但非光化学猝灭NPQ却逐渐升高,这说明在UVB、蓝光和极昼条件下南极衣藻的PSⅡ反应中心发生了光抑制。结论:本研究克隆获得南极衣藻C.sp.ICE-L隐花色素基因CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1,并进行初步生物信息学分析。通过在不同胁迫条件下探究南极衣藻C.sp.ICE-L隐花色素基因的表达模式,发现CiCRY-DASH1和CiPlant-CRY1为生物钟的关键组分;参与了蓝光、黄光甚至是红光下的光信号转导途径;能响应极昼和极夜处理,且响应能力强,并表现出一定的昼夜节律性。通过进行原核表达,为后续隐花色素基因的功能表征提供了基础。叶绿素荧光分析发现UVB、蓝光和极昼条件是可能影响极地环境中藻类的生理和代谢的胁迫条件。