研究背景:近年来,由于生活方式的改变和生存环境的恶化,我国各种肝脏疾病发病率呈上升趋势。目前,多种良恶性肝脏疾病的治疗方法最有效的仍然是肝部分切除术,但是切除过大有可能出现肝功能衰竭,切除过小则会引起肿瘤复发或者不能完全根治肝脏疾病。然而,肝脏与其它脏器不同的是,它具有一定的再生能力。所以,用什么方法可以加快肝细胞增殖的速率成为近年来肝胆科的研究重点。但是,目前研究最多的是怎样利用药物保护肝功能,避免肝衰竭,而对其再生机制的研究甚少。如果能够阐明肝再生的机制,则可以控制其中抑制增殖的环节,从而加快肝再生速率,使肝衰竭的患者迅速恢复肝功能。但是,肝部分切除术后肝脏再生的机制非常复杂,不是单个肝脏实质器官的再生,而是由于肝切除术后引起的全身各个系统的应激反应,包括各种细胞因子,免疫因子,炎症因子,以及体内多种离子,多个脏器的共同参与。这是研究肝再生机制的难点。Tmub1是近年来在研究肝细胞增殖的过程中发现的一种含有泛素样结构域的核-胞浆穿梭蛋白,在正常肝脏的肝细胞内主要位于细胞浆中,它包含有1个类似泛素结构的区域,在增殖周期中,它可以穿梭于细胞浆和细胞核之间,Tmub1蛋白在肝细胞增殖期逐渐向细胞核内穿梭,在增殖后期,则几乎全部穿梭进入细胞核[1-5]。细胞增殖期,细胞核内的主要活动是DNA的复制和姐妹染色体的分离,所以Tmub1蛋白应该在细胞核内参与了细胞增殖的过程,但是具体的机制目前尚不清楚。Securin即分离酶抑制蛋白,是参与细胞周期调控的重要物质,质量约22KD,由202个氨基酸残基组成,在多种肿瘤中高表达[6,7]。在正常的增殖细胞核内,粘着蛋白复合体使两条姐妹染色单体相连,活化的分离酶将粘着蛋白复合体分解后,姐妹染色单体分离[7]。securin通过抑制分离酶的活化,从而抑制染色体过早分离,在有丝分裂后期,securin蛋白N末端的毁坏盒与后期促进复合物连接,并在多种酶类参与下被泛素化降解,从而使分离酶活化。securin参与了有丝分裂,凋亡,细胞周期的进程以及DNA的修复等关键的细胞活动[7]。我们从结构上分析,tmub1蛋白内有泛素样结构域,而securin蛋白可以与泛素结合,也就是说securin蛋白有泛素结合域,所以tmub1蛋白可与securin蛋白结合。tmub1蛋白在g1期几乎完全表达于细胞质内,而当细胞进入g2期则大量穿梭进入细胞核,而此时正是增殖细胞的有丝分裂准备期[3-5]。因此,tmub1蛋白与securin蛋白同时具有结构以及空间的的可结合性。所以,如果能够证明肝部分切除术后肝细胞增殖的过程中tmub1蛋白能够与securin结合,并且能够影响肝细胞的增殖进程,将对我们今后预防和治疗肝切除术后肝功能衰竭具有重要的意义,并且对其它器官及细胞的增殖研究也有重要的借鉴作用。研究目的:1.证实肝部分切除术后tmub1蛋白能够与securin蛋白结合。2.明确tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用。材料方法:1.(1)建立大鼠70%的肝切除模型,动物实验采用40只大鼠随机分为5组,每组8只,第一组行肝切除术后直接灌注肝脏并取原代肝细胞,其余4组首先行肝部分切除术,分别于术后12,24,48,72h灌注肝脏并取原代肝细胞。(2)提取原代肝细胞tmub1蛋白和securin蛋白。(3)其中一部分首先进行免疫共沉淀实验,然后进行western-blot实验了解tmub1蛋白与securin蛋白的结合及其随肝切除术后时间的变化趋势;另外一部分直接进行western-blot实验,了解细胞内tmub1的变化趋势。2.(1)构建过表达tmub1慢病毒载体及阴性空载体对照。(2)构建沉默tmub1慢病毒载体及阴性空载体对照。3.(1)分别使用沉默tmub1慢病毒载体、过表达慢病毒载体及对应的空载体转染大鼠brl-3a肝细胞系,得到稳定转染的细胞。(2)转染后行流式细胞术及mtt检测细胞周期,各组间细胞周期进行对比,了解tmub1蛋白对肝细胞增殖的作用。结果:1.建立了的稳定的大鼠70%肝切除模型。2.通过co-ip技术证实tmub1蛋白和securin间相互结合。免疫共沉淀后进行western-blot得到蛋白条带显示tmub1蛋白与securin蛋白在肝切除术后相互结合。从条带的结果看,在肝切除术后0h条带灰度值较低,随着切除术后时间增加逐渐增强,到48h最高,72h再次下降。3.术后Tmub1蛋白western-blot检测发现肝切除术后各时相点Tmub1蛋白含量未发生明显改变。直接Tmub1蛋白western-blot实验发现术后各时相点条带亮度基本相同,IMAGE J图像分析软件分析各组每个灰度值,并进行统计学分析,术后各时相点Tmub1蛋白含量无显著差异(p>0.05)。4.成功构建了过表达Tmub1慢病毒载体、阴性空载体对照及沉默Tmub1慢病毒载体、阴性空载体对照。5.通过LV-Tmub1、LV-Tmub1阴性空载体对照及LV-Tmub1-RNAi、LV-Tmub1-RNAi阴性空载体对照转染各组细胞与正常生长的BRL-3A细胞组提取总蛋白,western-blot检测发现过表达组Tmub1蛋白条带明显增强,而沉默组条带明显减弱,IMAGE J图像分析软件分析各组每个灰度值,并进行统计学分析,过表达组Tmub1蛋白条带与沉默组条带差异有统计学意义(p<0.01),其它各组之间差异无统计学意义(p>0.05)。6.MTT实验检测细胞增殖将LV-Tmub1、LV-Tmub1阴性空载体对照及LV-Tmub1-RNAi、LV-Tmub1-RNAi阴性空载体对照转染各组细胞与正常生长的BRL-3A细胞培养48小时后,进行MTT比较,通过酶标仪检测各组OD值,发现过表达Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞OD值明显高于沉默Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞。7.流式细胞术检测细胞周期通过Tmub1过表达慢病毒载体(LV-Tmub1)、阴性空载体对照及Tmub1沉默慢病毒载体(LV-Tmub1-RNAi)、阴性空载体对照转染各组细胞后,与正常生长的BRL-3A细胞进行比较,通过流式细胞仪检测各细胞周期,发现过表达Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞G2+S期明显高于沉默Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞G2+S期,差异有统计学意义(p<0.01)。结论:1.肝部分切除术后Tmub1蛋白与securin蛋白结合。2.Tmub1在肝切除术后12小时开始从胞浆中穿梭进入细胞核,并与securin蛋白相互结合,48小时到达高峰后逐渐下降,而细胞内Tmub1蛋白本身的含量并未发生明显改变。3.Tmub1蛋白能够促进肝细胞增殖。