缺血性脑血管疾病(Ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是指包括短暂性脑缺血发作、脑梗塞和烟雾病在内的颅内血管病变，其引起的主要病理变化为脑缺血损伤。引起脑缺血损伤的病理生理机制非常复杂，目前研究主要集中在氧自由基、兴奋性氨基酸、细胞内钙超载、炎症反应和细胞凋亡几个方面。其中，小胶质细胞介导的炎症反应在脑缺血损伤所致的神经毒性方面占据重要地位。　　PKM2是丙酮酸激酶(Pyuvate kinase，PK)的一种亚型，是糖酵解过程中最后一步反应的限速酶，它能使磷酸烯醇式丙酮酸脱羧生成丙酮酸并产生ATP。PKM2主要表达在胚胎细胞、肿瘤细胞等一些快速分裂增殖的细胞中。目前对于PKM2的研究主要集中在肿瘤细胞中，大量研究表明，PKM2在促进肿瘤细胞的分裂增殖、维持细胞内氧化还原稳态等方面具有重要作用。肿瘤细胞具有特有的Warburg效应，即在氧气充足的情况下葡萄糖还是主要经无氧酵解使细胞更多地产生乳酸、一些生物小分子及NADPH，研究表明PKM2在这一过程中发挥着至关重要的调控作用。当脑组织发生缺血时，脑组织细胞也会发生类似肿瘤细胞的代谢过程的改变，但PKM2在缺血性脑血管疾病发生过程中是否发挥作用及相关机制尚未见报道。　　本课题主要研究PKM2在脑缺血损伤中的作用及相关作用机制。我们首先利用栓线法制备大鼠大脑中动脉阻塞模型，免疫组化结果显示，PKM2在大鼠脑小胶质细胞中表达，并在脑缺血后表达升高。进而，我们选用BV-2细胞建立两种细胞缺氧模型:即利用含250μM CoCl2的无血清培养基培养细胞建立化学缺氧模型，利用含1％ O2，5％ CO2 and94％ N2的37℃培养箱培养细胞建立物理缺氧模型。Western blot和实时定量PCR结果显示，无论在物理缺氧还是化学缺氧处理的细胞中，PKM2 mRNA表达水平较正常细胞均显著升高，此外，PKM2与缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的蛋白表达水平在缺氧的诱导下有着一致的高表达趋势。该结果提示我们，PKM2在缺氧的小胶质细胞中可能发挥着重要的生物学功能。进一步研究发现，PKM2和HIF-1α的蛋白表达水平在缺氧的BV-2细胞核中与对照组相比显著升高，而在细胞浆中无明显变化。该结果说明PKM2在缺氧BV-2细胞中的表达升高可能主要与它在核内的蛋白激酶的功能有关。此外，我们还发现缺氧BV-2细胞中PKM2的表达升高与HIF-1α的直接调控相关:首先，我们向BV-2细胞中转染入HIF-1α siRNA，发现细胞中PKM2的mRNA水平较对照组显著降低，而转染入HIF-1α的表达质粒则显著升高了PKM2 mRNA水平;其次，为了进一步明确这种调控机制，我们采用HIF-1α的单克隆抗体进行染色质免疫共沉淀实验，使用针对小鼠PKM2 HRE序列的特异引物对提纯的DNA片段进行PCR扩增发现，HIF-1α是直接结合在PKM2的HRE序列上的，并且在缺氧诱导下这种结合增多;最后，为了证明HIF-1α与PKM2 HRE序列的结合是有功能的，我们构建了含有PKM2-HRE序列的报告质粒。HEK-293T细胞首先被转染入pGL3-HRE报告质粒，然后对细胞进行CoCl2诱导可以增强其荧光素酶活性。此外，向细胞中先后转染HIF-1αsiRNA和pGL3-HRE质粒，我们发现干扰HIF-1α的表达可以明显降低该位点的转录活性。综合以上结果，我们推断，当小胶质细胞受到缺氧-缺血刺激后，细胞内的HIF-1α蛋白更多地与PKM2的HRE基因片段结合并促进PKM2的转录。　　已经有文献报道，人肺癌细胞中升高的活性氧(reactive oxygen species，ROS)可以通过氧化PKM2 Cys358来抑制其催化酶活性使细胞更能对抗ROS毒性。在缺氧的BV-2细胞中，我们观察到ROS的生成量和炎症介质（IL-1β、IL-6、IL-18和VCAM-1）的转录水平与正常组相比都明显升高。在BV-2中转染入PKM2的表达质粒可以使这几种细胞炎症介质mRNA表达水平显著增加，而与转染PKM2表达质粒的细胞相比，转入Cys358位点突变质粒的细胞可以中和这种升高。由此，我们可以推断PKM2在小胶质细胞中的促炎作用是通过C358位点的氧化实现的。　　综上所述，在缺氧缺血刺激下，小胶质细胞中PKM2的表达受到HIF-1α的直接调控，其表达的上升促进了IL-1β、IL-6、IL-18和VCAM-1的基因转录，从而影响了细胞内的炎症过程。本研究首次对PKM2在缺氧缺血小胶质细胞中的生物学作用进行了研究，从HIF-1α-PKM2信号通路这一角度为缺血性脑血管疾病的防治提供了一个潜在的靶点，具有重要的理论意义。