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目的:本研究旨在探讨在抑郁症发病过程中,NLRP3炎症小体通路的过度活化是否与其负向调控机制线粒体自噬失活有关;明确小建中汤是否具有抗抑郁作用,能否有效逆转CUMS大鼠抑郁样行为,以及小建中汤治疗抑郁症的药理机制是否与上调抑郁模型大鼠海马线粒体自噬水平,改善线粒体功能,抑制TLR4/NF-κB通路和NLRP3炎症小体活化有关;明确小建中汤对NLRP3炎症小体通路的抑制作用是否依赖于PINK-1/Parkin途径介导的线粒体自噬。进一步探讨小建中汤调摄阴阳、温健脾气、生发肝气之功对抑郁症的作用机理。方法:1.实验一:SD大鼠40只,除空白组大鼠(n=8)外,应用CUMS造模,3周后测试大鼠体重和蔗糖偏好率,判断造模是否成功,造模成功的大鼠随机分为模型组(n=8)、氟西汀组(n=9)和雷帕霉素组(n=9)。分别给予药物治疗3周,同时继续进行CUMS造模。治疗结束后对大鼠实施行为学检测,取海马组织和血清。RT-PCR检测mt DNA拷贝数,线粒体自噬相关m RNA(PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62)变化,NLRP3炎症小体相关m RNA(NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18)变化;Western-Blot检测线粒体自噬相关蛋白(PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62)变化,NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18)变化;ELISA检测血清IL-1β、IL-18、DA和5-HT变化。2.实验二:SD大鼠60只,除空白组大鼠(n=7)外,应用CUMS造模,3周后测试大鼠体重和蔗糖偏好率,判断造模是否成功,造模成功的大鼠随机分为模型组(n=7)、氟西汀组(n=7)、小建中低剂量组(n=8)、小建中中剂量组(n=8)和小建中高剂量组(n=8)。分别给予药物干预3周,同时继续进行CUMS造模。治疗结束后对大鼠实施行为学检测,继而取海马组织和血清。尼氏染色检测海马CA3区锥体细胞形态,透射电镜观察海马CA3区锥体细胞和线粒体超微结构;RT-PCR检测mt DNA拷贝数,线粒体自噬相关m RNA(PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62)变化,NF-κB信号通路相关m RNA(TLR4、IκB-α、NF-κB1、RELA和TNFα)变化,NLRP3炎症小体相关m RNA(NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18)变化;Western-Blot检测线粒体自噬相关蛋白(PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62)变化,NF-κB信号通路相关蛋白(TLR4、p-IκB-α、p-p50和p-p65)变化;Western-Blot和免疫荧光检测NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18)变化;ELISA检测血清IL-1β、IL-18、DA、5-HT、SOD和MDA变化。3.实验三:SD大鼠50只,除空白组大鼠(n=7)外,应用CUMS造模,3周后测试大鼠体重和蔗糖偏好率,判断造模是否成功,造模成功的大鼠随机分为模型组(n=8)、氟西汀组(n=8)、小建中组(n=8)和小建中+抑制剂组(n=8)。分别给予药物治疗3周,同时继续进行CUMS造模。治疗结束后对大鼠实施行为学检测,继而取海马组织。RT-PCR检测线粒体自噬相关m RNA(PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62)变化,NLRP3炎症小体相关m RNA(NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18)变化;Western-Blot检测线粒体自噬相关蛋白(PINK-1、Parkin、Beclin-1、LC3B、P62)变化,NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18)变化。结果:1.CUMS模型大鼠行为学、线粒体自噬和NLRP3炎症小体通路变化1.1.行为学:与空白组相比,模型组大鼠体重和蔗糖偏好率明显下降(P<0.01);从强迫游泳实验(FST)结果来看,模型组大鼠不动时间明显延长(P<0.01);从旷场实验(OFT)结果来看,模型组大鼠水平得分、垂直得分、运动总距离、运动总时间均下降(P<0.01)。1.2.线粒体自噬:与空白组比较,模型组大鼠海马PINK-1、Parkinh和Beclin-1的m RNA相对表达量明显减少(P<0.01),P62的m RNA相对表达量增多(P<0.01);与空白组比较,模型组大鼠海马PINK-1、Parkin、Beclin-1和LC3B2/1的蛋白表达水平明显下降(P<0.01),P62蛋白表达明显上升(P<0.01)。CUMS大鼠海马线粒体自噬水平降低。1.3.NLRP3炎症小体通路:与空白组比较,模型组大鼠海马NLRP3(P<0.05)、ASC(P<0.01)、caspase-1(P<0.01)、IL-1β(P<0.05)和IL-18(P<0.01)的m RNA相对表达量明显增多;与空白组比较,模型组大鼠NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。在CUMS大鼠海马出现了NLRP3炎症小体活化和神经炎症反应。2.雷帕霉素对CUMS模型大鼠行为学、线粒体自噬和NLRP3炎症小体通路的作用2.1行为学:与模型组比较,雷帕霉素组大鼠的蔗糖偏好率显著升高(P<0.01),FST不动时间显著降低(P<0.01)。雷帕霉素逆转了CUMS大鼠的抑郁样行为。2.2线粒体自噬:与模型组比较,雷帕霉素组大鼠海马PINK-1(P<0.01)、Parkin(P<0.05)、Beclin-1(P<0.05)的m RNA相对表达量增多,P62的m RNA相对表达量减少(P<0.01);与模型组比较,雷帕霉素组大鼠海马PINK-1、Parkin、Beclin-1和LC3B2/1的蛋白表达水平升高(P<0.01),P62蛋白表达下降(P<0.01)。雷帕霉素上调了CUMS大鼠海马线粒体自噬水平。2.3 NLRP3炎症小体通路:与模型组比较,雷帕霉素组大鼠海马NLRP3(P<0.01)、caspase-1(P<0.05)、ASC(P<0.01)、IL-1β(P<0.01)和IL-18(P<0.01)的m RNA相对表达量减少;同时,雷帕霉素组大鼠NLRP3、caspase-1 p20、ASC、IL-1β和IL-18的蛋白表达下降(P<0.01)。雷帕霉素抑制了CUMS大鼠海马NLRP3炎症小体活化。3.小建中汤对CUMS模型大鼠行为学的影响与模型组比较,小建中低、中、高剂量组大鼠体重均显著增加(P<0.01);与模型组比较,小建中低、中、高剂量组大鼠的FST不动时间明显减少(P<0.01);与模型组比较,低剂量和中剂量组大鼠OFT水平得分也有所增加(P<0.05),小建中低、中、高剂量组大鼠的垂直得分、运动总距离和运动总时间明显上升(P<0.01)。小建中汤显著逆转了CUMS大鼠抑郁样行为。4.小建中汤对CUMS模型大鼠线粒体自噬的调控与模型组比较,小建中汤低剂量组大鼠海马PINK-1(P<0.01)、Parkin(P<0.05)的m RNA相对表达量增多,P62(P<0.01)的m RNA相对表达量减少;小建中汤中剂量和高剂量组大鼠海马PINK-1(P<0.01)、Parkin(P<0.05)和Beclin-1(P<0.01,P<0.05)的m RNA相对表达量增多,P62的m RNA相对表达量减少(P<0.01)。与模型组比较,小建中汤低剂量组大鼠海马PINK-1、Parkin和Beclin-1的蛋白表达水平明显上调(P<0.01),P62的蛋白表达水平下降(P<0.01);小建中汤中剂量和高剂量组大鼠海马PINK-1、Parkin、Beclin-1和LC3B2/1(P<0.01)的蛋白表达上调,P62的蛋白表达下降(P<0.01)。小建中汤通过PINK-1/Parkin途径上调了CUMS大鼠海马区线粒体自噬水平。5.小建中汤对CUMS模型大鼠mt DNA拷贝数的影响与空白组比较,模型组大鼠海马mt DNA拷贝数增多(P<0.01)。与模型组比较,小建中汤低、中、高剂量组大鼠海马mt DNA拷贝数明显增多(P<0.01)。小建中汤明显上调了CUMS大鼠海马神经元的线粒体拷贝数,增加了线粒体数量。6.小建中汤对CUMS模型大鼠血清SOD和MDA的影响与空白组比较,模型组大鼠血清SOD(P<0.01)表达量减少,MDA(P<0.01)表达量明显增多;与模型组比较,小建中汤低、中、高剂量组大鼠血清SOD(P<0.05,P<0.01,P<0.01)表达量明显减增多,MDA(P<0.01,P<0.05,P<0.01)表达量明显减少。小建中汤改善了CUMS大鼠脂质过氧化水平。7.小建中汤对CUMS模型大鼠TLR4/NF-κB信号通路的影响与空白组比较,模型组大鼠海马TLR4、IκB-α、NF-κB1、RELA和TNF-α的m RNA相对表达量增多(P<0.01);与模型组比较,小建中汤低、中、高剂量组大鼠海马TLR4(P<0.01)、IκB-α(P<0.01)、NF-κB1(P<0.01)、RELA(P<0.01)和TNF-α(P<0.01,P<0.01,P<0.05)的m RNA相对表达量减少。与空白组比较,模型组大鼠海马p-p50、p-p65、p-IκB-α和TLR4的蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,小建中汤低、中、高剂量组大鼠海马p-p50、p-p65、p-IκB-α和TLR4的蛋白水平降低(P<0.01)。小建中汤抑制了CUMS大鼠海马TLR4/NF-κB信号通路的激活。8.小建中汤对CUMS模型大鼠NLRP3炎症小体通路的作用与模型组比较,小建中汤低、中、高组大鼠海马NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的m RNA相对表达量和蛋白表达水平均降低(P<0.01)。小建中汤抑制了CUMS大鼠海马NLRP3炎症小体的活化。9.小建中汤对CUMS模型大鼠血清5-HT和DA的影响与空白组比较,模型组大鼠血清中DA(P<0.01)和5-HT的蛋白水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,小建中汤低、中、高剂量组大鼠血清DA和5-HT的表达上调(P<0.01)。小建中汤增加了CUMS大鼠血清5-HT和DA水平。10.小建中汤+线粒体自噬抑制剂对CUMS模型大鼠线粒体自噬的影响与小建中组相比,小建中+抑制剂组大鼠PINK-1(P<0.01)、Parkin(P<0.05)、Beclin-1(P<0.01)的m RNA相对表达量减少,P62(P<0.01)的m RNA相对表达量增多;与小建中组比较,小建中+抑制剂组大鼠海马PINK-1、Parkin、Beclin-1和LC3B2/1的蛋白表达水平明显下降(P<0.01),P62蛋白表达明显上升(P<0.01)。线粒体自噬抑制剂减弱了小建中汤对CUMS大鼠线粒体自噬的正向调控作用。11.小建中汤+线粒体自噬抑制剂对CUMS模型大鼠NLRP3炎症小体通路的影响与小建中组相比,小建中+抑制剂组大鼠海马NLRP3(P<0.01)、ASC(P<0.05)、caspase-1(P<0.01)、IL-1β(P<0.01)和IL-18(P<0.01)的m RNA和蛋白表达均上升。线粒体自噬抑制剂减弱了小建中汤对CUMS大鼠NLRP3炎症小体的抑制作用。结论:1.CUMS抑郁模型大鼠海马区同时存在线粒体自噬水平低下和NLRP3炎症小体通路的过度活化,这可能是抑郁症的重要机制之一。2.线粒体自噬激动剂雷帕霉素改善了CUMS大鼠的抑郁样行为,降低了NLRP3炎症小体各组分和下游炎症因子的表达水平。雷帕霉素通过上调线粒体自噬水平抑制了NLRP3炎症小体的过度活化。进一步验证了在抑郁症发病过程中,NLRP3炎症小体的活化可能与其负向调控机制线粒体自噬失活有关。3.小建中汤通过改善CUMS大鼠自主活动,减少CUMS大鼠强迫游泳不动时间,有效逆转了CUMS大鼠抑郁样行为,具有明确的抗抑郁作用。4.小建中汤治疗抑郁症的药理机制可能与上调CUMS大鼠海马区PINK-1/Parkin途径介导的线粒体自噬水平,增加mt DNA拷贝数,改善线粒体功能,抑制TLR4/NF-κB通路和NLRP3炎症小体活化,减少炎症因子的释放有关。5.小建中汤对NLRP3炎症小体的抑制作用依赖于其对PINK-1/Parkin途径介导的线粒体自噬的调节。