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本实验室前期的研究结果显示，用热水浸提60%乙醇沉淀提取的马尾松花粉多糖（PPM60）经硫酸酯化修饰后能明显促进小鼠脾脏混悬淋巴细胞的增殖，且硫酸酯化多糖（SPPM60）同脂多糖（LPS）都能显著升高脾细胞[Ca2+]i及脾细胞上清中IL-2和IL-4的水平。同时证实了TOLL样受体4（TLR4）是淋巴混悬细胞表面一个与SPPM60发挥作用相关的表面受体，并可以通过TLR4-PI3K-PLC信号通路引起细胞内钙离子浓度的变化。由于脾脏富含T、B淋巴细胞，为了进一步探明松花粉多糖及其酯化物对于脾脏T淋巴细胞具体作用机制，实验室前期还研究了SPPM60对分离纯化的脾脏T淋巴细胞的作用，发现其能显著促进T淋巴细胞的增殖、[Ca2+]i的升高以及T淋巴细胞上清中IL-2和IL-4的水平，同时伴随着T细胞内PI3K-PLC-IP3R-Ca2+信号通路的激活，此外还证实了细胞外的钙离子是通过CRAC通道大量内流而造成[Ca2+]i升高的。同时发现，SPPM60对T细胞的活化作用并不依赖于TLR4，猜测其可能是通过TCR/CD3来活化T细胞的。上述结果都显示了SPPM60对脾脏混悬淋巴细胞和其中T淋巴细胞的作用，而目前仍没有PPM60及SPPM60对脾脏B淋巴细胞作用的相关报道。本实验从体外角度通过检测PPM60组分之一（PPM60-D）酯化前后对B淋巴细胞增殖、[Ca2+]i和抗体生成的影响情况，从而研究PPM60-D酯化前后对B淋巴细胞的作用效果，并对其作用机制进行初步研究。实验主要分为以下几个部分：一、用热水浸提乙醇沉淀法提取马尾松花粉粗多糖，经三氯乙酸法除去其中的蛋白质后，分别用40%、60%、80%的乙醇对多糖进行分级沉淀。本实验选取其中60%乙醇沉淀的多糖组分经聚丙烯酰胺凝胶柱层析对其进行进一步地分离纯化，得到一种较均一的多糖组分，并将其命名为PPM60-D。称取25mg的PPM60-D，用氯磺酸-吡啶法对其进行硫酸酯化，得到硫酸酯化多糖SPPM60-D31.6mg。最后用氯化钡-明胶比浊法测定SPPM60-D的取代度为1.202。用红外光谱检测显示其有S=O和C-O-S的特征吸收峰，表明PPM60-D硫酸酯化成功。二、用尼龙毛纤维法分离小鼠脾脏B淋巴细胞，MTT法分别检测PPM60-D和SPPM60-D在不同作用浓度和时间下对B淋巴细胞增殖的影响。结果发现，200μg/mL的SPPM60-D在作用48h时，对小鼠脾脏B淋巴细胞的促增殖效果最佳，达13.88%。而PPM60-D对小鼠脾脏B细胞的增殖也有一定的作用，但效果较弱，为7.13%。三、用双波长荧光分光光度计检测经200μg/mL PPM60-D和SPPM60-D处理B淋巴细胞后[Ca2+]i的变化。与空白对照组相比PPM60-D和SPPM60-D都能使B淋巴细胞内[Ca2+]i显著升高，SPPM60-D的作用效果更强。2-APB、U73122和TAK-242能较大地抑制SPPM60-D引起的B淋巴细胞内[Ca2+]i升高。LY294002和Verapamil也能部分抑制SPPM60-D所引起的小鼠脾脏B淋巴细胞[Ca2+]i的升高。而低分子肝素则能完全抑制SPPM60-D所引起的B淋巴细胞[Ca2+]i的升高，并且使B淋巴细胞[Ca2+]i低于空白对照水平。四、利用溶血空斑实验（PFC）和定量溶血分光光度法（QHS）检测SPPM60-D或PPM60-D刺激B细胞后，对其抗体生成的影响。结果表明无论是通过体外免疫，还是通过体内免疫体外多糖刺激，200μg/mL的SPPM60-D都能显著促进B细胞的抗体生成水平，并且在体外有较快的作用效果。而PPM60-D也能显著促进B细胞的抗体生成水平，但效果要比SPPM60-D弱。以上结果表明：（1）PPM60-D和SPPM60-D都能显著促进小鼠脾脏B淋巴细胞的增殖、[Ca2+]i的升高和抗体的生成，且SPPM60-D的作用效果要强于PPM60-D。（2）推测SPPM60-D促进小鼠B淋巴细胞的增殖和抗体生成可能是通过提高其[Ca2+]i而造成的。（3）推测SPPM60-D所引起的小鼠脾脏B淋巴细胞[Ca2+]i的升高可能与SOC通道及TLR4-PI3K-PLC-IP3信号通路有关。