背景:多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)是一种伴随着神经细胞死亡,髓鞘脱落的中枢神经系统自身免疫性疾病,患者常出现幻视及认知障碍等临床症状。MS的发病机制尚不明确,目前大多数研究者认为MS的发生是环境因素和遗传因素共同影响的结果。MS的临床治疗药物仍停留在免疫调节剂及免疫抑制剂阶段,但均疗效有限且存在严重的副作用。维生素D(Vitamin D,VD)作为人体内必需的微量有机物质,主要在调节人体内的钙稳态方面发挥重要作用。近年来,VD在免疫系统疾病及癌症治疗方面的作用逐渐受到关注。流行病学调查显示,MS发病率与光照有显著相关性。光照可催化体内VD合成,科学家们推测MS与VD具有相关性。随后的研究发现,MS病人体内,维生素D的含量明显降低,且维生素D的缺乏可增加MS的患病风险。进一步研究发现,在实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)动物模型实验中,补充维生素D能显著缓解模型动物的EAE症状。目前关于维生素D缓解MS/EAE的作用研究已有些报道,但其具体作用机制仍不甚明确。因此,深入探讨维生素D缓解MS/EAE作用机制,可为维生素D的临床应用提供必要的实验依据,具有重要的理论和实践意义。一,PC12细胞中维生素D对神经酰胺的影响作用研究鞘脂是一类参与到多种生物学功能和病理学过程中的脂类物质。神经酰胺(Ceramide,Cer)作为鞘脂类的中心代谢产物参与多种细胞活动,如细胞迁移,凋亡过程及炎症反应。短链神经酰胺及内源性神经酰胺能够促进PC12细胞的凋亡,主要表现为促进细胞核的破碎和核内DNA的损伤。近年来的研究发现在EAE大鼠的脊髓内,C16:0-Cer的含量显著升高,神经酰胺合酶6的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著升高,这表明Cer与EAE/MS的发生发展有关。本课题组的前期工作表明,维生素D能显著降低EAE大鼠脊髓内Cer下游代谢产物鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine 1-phosphate,S1P)的含量并缓解EAE大鼠发病进程,但是作用机制尚不明确。因此,本研究利用PC12细胞,探讨维生素D对神经酰胺的影响作用并对其作用机制进行研究,为维生素D缓解MS/EAE的作用机制研究提供细胞水平的实验依据。目的:阐明在PC12细胞中维生素D对神经酰胺的影响作用。为VD治疗MS的机制研究提供细胞水平的实验依据。方法:1,采用 MTT 法检测 C2-Cer(20,10,5,2.5,1.25,0.62,0μM)处理的PC12细胞的细胞活性。2,采用HPLC-MS的方法检测维生素D(50nM和OnM)处理的PC12细胞中C16:0-Cer的含量。3,采用RT-PCR法检测维生素D(50nM和OnM)处理的PC12细胞中神经酰胺合成和代谢相关酶的含量。其中包括存在于脊髓中的神经酰胺合成相关酶,SPT(SPTLC1,SPTLC2),Cers(Cers1,Cers2,Cers3,Cers5,Cers6),以及神经酰胺的代谢相关酶 Cerk,Smpd1-3,Sgsm1,Asah,Gba,Sms。4,采用 Western Blot 法检测维生素 D(200,100,50,25,12.5,0nM)处理的PC12细胞中SPTLC1和Cers6的蛋白表达水平。结果:1,随神经酰胺(C2-Cer)刺激浓度增加PC12细胞的存活率逐渐下降,并表现出剂量依赖性(P***<0.05)。2,在50 nM维生素D刺激后的PC12的中C16:0-Cer的含量显著低0nM维生素D刺激后的PC12细胞(P*<0.05)。说明维生素D具有降低C16:0-Cer的含量的作用。3,在50nM维生素D刺激后的PC12细胞中丝氨酸棕榈酰转移酶1(SPTLC1)的mRNA表达水平显著高于0nM维生素D刺激后的PC12细胞(P***<0.05)。CerS6的mRNA表达水平同样显著高于0nM维生素D刺激的PC12细胞(P***<0.05)。4,在维生素D刺激后的PC12细胞中SPTLC1的蛋白表达随着维生素D浓度的升高显著降低,当维生素D浓度为50nM时SPTLC1的相对蛋白表达量达到最低水平(P***<0.05)。而Cers6的蛋白表达水平显著升高,当维生素D浓度为200nM时Cers6的相对蛋白表达量达到最高(.P***<0.05)。结论:维生素D可能通过降低神经酰胺的从头合成的限速酶SPTLC1的蛋白表达水平来降低细胞内C16:0-Cer的含量,从而降低神经酰胺对PC12细胞凋亡的促进作用。因此,我们推测,在MS中,维生素D也可能通过降低神经酰胺的促神经细胞凋亡的作用,起到缓解MS的效果,为维生素D治疗MS的机制研究提供了新思路。二,基于iTRAQ技术筛选补充维生素D前后EAE大鼠血清中的差异蛋白相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)是一种基于等重同位素标记的相对和绝对定量技术,是近年来发展迅速的定量蛋白质组学高通量筛选技术。目的:应用iTRAQ技术,筛选诱导EAE前后及补充维生素D与未补充维生素D的EAE大鼠血清中表达差异的蛋白,筛选与EAE发病相关的血清标志物,同时,为维生素D治疗MS/EAE机制提供新思路。方法:制备EAE大鼠模型,并收集血清。采用iTRAQ技术对正常(C组),EAE发病组(EAE)和补充维生素D的EAE发病组(VE)大鼠血清进行蛋白质组学分析。1,构建EAE大鼠模型和补充维生素D:取18只大鼠平均分为三组,正常组(C组,6只),发病组(EAE组,6只),补充维生素D发病组(VE组,6只)。诱导EAE大鼠模型,应用等体积完全弗氏佐剂(CFA,含5mg/ml的百日咳疫苗)和碱性髓鞘蛋白溶液(MBP,1mg/ml)混合液注射Lewis大鼠双侧足垫,自免疫之日起,记录大鼠体重及评分情况。免疫发病后,处死大鼠,取大鼠心脏全血,离心取血清。2,iTRAQ筛选EAE诱导前后及维生素D补充前后大鼠血清中差异表达的蛋白:每组中每三只大鼠血清混合为一个样品池,去除血清中高丰度蛋白后定量,酶解获得肽段。利用同位素标记肽段,SCX分级随后进行梯度Q-exactive分析,共计15次LC-MS/MS分析。得到原始质谱数据后通过Proteome Discoverer分析软件检索数据库获得差异表达蛋白。3,筛选C组与E组大鼠血清中表达差异的蛋白及VE组与E组大鼠血清中表达差异的蛋白。4,通过GO功能注释和KEGG通路分析等生物信息学方法分析差异蛋白的功能属性及作用通路。结果:1,成功构建EAE大鼠模型。2,按照P-value小于0.05且表达差异倍数大于1.2倍的标准,筛选差异表达的蛋白。E组与C组相比,筛选出74种具有差异表达的蛋白,其中上调的蛋白42种,下调的蛋白32种;VE组与E组相比,筛选出80种差异表达的蛋白,其中上调蛋白40种,下调蛋白40种。其中E/C和VE/E中表达均变化的蛋白有20种。3,生物信息学分析表达差异蛋白的功能及作用通路。4,选择 Proterin S100-A8 和 Interleukin 1 receptor antagonist 作为候选蛋白。它们不仅与EAE的发病相关而且能在维生素D的作用时下调。结论:本实验首次将定量蛋白质组学技术应用于EAE鼠血清中筛选差异表达的蛋白。我们筛选出了 74种在EAE鼠与正常鼠血清中的表达差异的蛋白,为EAE发病机制的研究提供了精确定量组学数据;我们还筛选出了 80种补充VD的EAE大鼠与不补充VD的EAE大鼠血清中的差异蛋白,为VD治疗MS的作用机制研究提供了新的突破点。通过对目标蛋白的分析,筛选出与脊髓损伤有关的蛋白如:Proterin S100-A8 和与 MS 发病相关的蛋白 Interleukin 1 receptor antagonist等,为进一步深入研究VD治疗MS的作用机制提供了新靶点和突破口。